白宇清 王定跃 谢利娟

（1深圳市梧桐山风景区管理处，广东深圳 518004；2深圳职业技术学院应用化学与生物技术学院，广东深圳 518055）

杜鹃花是世界4大著名花卉之一，也是我国10大传统名花之一［1］。其中，毛棉杜鹃（Rhododendron moulmainense Hook.f.）是分布最南的高山杜鹃，为杜鹃花科常绿小乔木，高3～8m，花期3—4月，盛花时粉色花朵覆盖整个树冠，观赏价值极高。毛棉杜鹃的大部分植株自然分布在梧桐山400～700m的较高海拔区域，而在深圳市区低海拔地带未见分布。目前，主要采取将梧桐山的毛棉杜鹃与山下低海拔地区适应性强的杜鹃杂交，以实现将毛棉杜鹃引种到低海拔地区的目的。为了便于毛棉杜鹃杂交育种的顺利开展，对毛棉杜鹃花粉活力的研究必不可少。

目前，杜鹃花粉常采用醋酸洋红、TTC以及MTT染色法测定其活力［2-3］，其中，MTT染色法与花粉体内萌发率最为接近［4］。Brewbaker-Kwack培养基用于测定杜鹃花的花粉活力［5］，该培养基也适用于其他植物花粉培养。国内外对杜鹃花花粉活力的测定方法及离体萌发培养基配方的研究仍较少，国内仅见有卜志国等［6］对映山红开花习性与花粉生活力的研究。为此，笔者以毛棉杜鹃花粉为试验材料，利用蔗糖、H3BO3、CaCl2单因素及正交试验筛选毛棉杜鹃花粉萌发的最佳培养基，同时找出快速且适宜的毛棉杜鹃花粉活力测定方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料毛棉杜鹃花粉采自深圳梧桐山风景区小梧桐停车场周边的野生毛棉杜鹃植株。花粉采集后带回实验室充分混合并自然干燥约24～36h，置于-20℃冰箱保存。

1.2 试验方法在双孔的凹型载玻片孔内滴入0.1mL的培养液，用牙签或针将花粉均匀点入培养液中，将载玻片放入保湿的培养皿内于25℃人工气候箱中，光照培养8h后在显微镜下观察统计。花粉管长度大于或等于花粉粒直径、四合体有一个萌发的花粉即视为已萌发，每处理统计10个视野，每个视野花粉不少于50粒，3个重复。

1.3 试验处理

1.3.1 蔗糖、H3BO3、CaCl2单因子试验 以毛棉杜鹃花粉为试验材料，蔗糖的质量浓度梯度为0、50、100、150、200、300g·L-1；H3BO3的质量梯度浓度为0、50、100、200、300、500mg·L-1；CaCl2的质量浓度梯度为0、50、100、200、300、500mg·L-1的培养基上进行萌发试验。

1.3.2 蔗糖、H3BO3、CaCl2正交试验 在单因子试验的基础上，进行L9（33）的正交试验。

1.3.3 染色法测定杜鹃花花粉活力 以毛棉杜鹃花粉为测定花粉活力，采用TTC、I2-KI、醋酸洋红染色法测定花粉活力。

2 结果与分析

2.1 蔗糖、H3BO3、CaCl2单因子试验

2.1.1 蔗糖 适当浓度的蔗糖能促进花粉管的萌发，因为适当浓度的蔗糖能维持花粉与培养基之间的渗透平衡，蔗糖浓度过高导致花粉管破裂，产生质壁分离现象，造成原生质体脱水，花粉不萌发［7］。由表1可知，蔗糖对毛棉杜鹃花粉管萌发的影响呈先增加后减小的变化趋势，毛棉杜鹃花粉萌发的蔗糖最佳浓度为50～200g·L-1。

表1 蔗糖对毛棉杜鹃花花粉萌发的影响

2.1.2 H3BO3H3BO3在植物体花中含量最高，其中柱头和子房的含量最高。H3BO3通过增加糖的吸收、转运和代谢，促进构成果胶物的合成，即促进花粉管壁的形成。一般花粉中的硼酸含量不足，需从柱头和花柱中转运补偿，因此在花粉离体培养中要添加一定量的硼酸［8］。由表2可知，H3BO3对毛棉杜鹃花粉管萌发的影响呈逐渐增加后减小的变化趋势，毛棉杜鹃花粉萌发的H3BO3的最佳浓度为50mg·L-1、100mg·L-1、200mg·L-1。

表2 H3BO3对毛棉杜鹃花花粉萌发的影响

2.1.3 CaCl2CaCl2是花粉萌发所需的物质，外源Ca2+的需求取决于花粉细胞内游离钙的含量。若内源钙充足，外源Ca2+会造成过高的细胞膨压、细胞中毒抑制花粉的萌发和花粉管的生长［7-8］。由表3可知，CaCl2对毛棉杜鹃花粉管萌发的影响呈逐渐增加的趋势，毛棉杜鹃花粉萌发的CaCl2最佳浓度为200mg·L-1、300mg·L-1、500mg·L-1。

表3 CaCl2对毛棉杜鹃花花粉萌发的影响

2.2 蔗糖、H3BO3和CaCl2三因子正交试验在单因子的基础上，确立蔗糖、H3BO3、CaCl2的浓度范围及各浓度梯度，进一步进行L9（33）正交试验，寻求最佳的培养基配方。由表4可知，毛棉杜鹃花粉在蔗糖200g·L-1、H3BO3100mg·L-1、CaCl2300mg·L-1时萌发率最高。

表4 毛棉杜鹃花花粉正交试验的萌发率

2.3 染色法测定杜鹃花花粉活力从各种染色剂对毛棉杜鹃花花粉的染色效果（图1）可以看出，TTC染色法测定毛棉杜鹃花花粉活力的效果并不明显，无法使花粉着色，即使经过长时间的染色也无法明确区分出是否具有活力，故不能作为测定毛棉杜鹃花花粉活力快速有效的染色剂；I2-KI染色法颜色差异不显著，无法区分花粉是否具有活力；醋酸洋红染色法能够在短时间内使花粉着色，且染色效果明显，容易区分，是一种较好的毛棉杜鹃花粉活力测定方法，具有简单、快捷的优点。

图1 各染色剂对毛棉杜鹃花花粉的染色效果

3 小结与讨论

蔗糖是植物花粉萌发所必需的成分，能为花粉萌发和花粉管生长提供营养物质，同时维持外界环境的渗透压［9］。蔗糖对花粉萌发的影响，因植物种类和浓度而不同。本试验结果表明：（1）毛棉杜鹃花粉率萌发随着花粉浓度的增加而提高，当蔗糖浓度为200g·L-1时，毛棉杜鹃花粉萌发率最高：（2）当硼的浓度为100、200mg·L-1时，毛棉杜鹃花粉萌发率最高，当大于200mg·L-1花粉萌发率逐渐下降：（3）毛棉杜鹃花粉随CaCl2浓度的增加而持续增加，说明毛棉杜鹃花粉需要高浓度的CaCl2来促进萌发。通过正交试验得出，毛棉杜鹃花粉萌发的最佳培养基为蔗糖200g·L-1+H3BO3100mg·L-1+CaCl2300mg·L-1。

卜志国等［6］研究表明，映山红的最佳蔗糖浓度为5%，而本研究中液体培养基适宜的蔗糖浓度与之有所不同。姚成义等［10］对蓝猪耳花粉萌发的研究及关军锋等［11］对苹果花粉萌发和花粉管生长的研究表明，花粉萌发时不需要外源的存在。本研究中，毛棉杜鹃花粉萌发结果与他们的研究结果不一致，这是由于不同植物、不同品种的花粉萌发的条件不同。

染色剂染色测定花粉活力，是一种快速、简单、快捷的方法。本试验得出，对于毛棉杜鹃来说，醋酸洋红染色法法能够在短时间内使花粉着色，且染色效果明显、容易区分，对毛棉杜鹃花粉活力的测定较准确。而TTC染色法和I2-KI染色法则不太适合毛棉杜鹃花花粉活力的测定。