江莉莎 郭述良

[摘要] 目的 研究噬菌体Guo1、Leo对不同模型休眠期结核分枝杆菌的裂解作用。 方法 利用ClustalX软件作多重序列对比，寻找噬菌体Guo1、Leo的motif3基序。分别用缺氧模型及缺钾模型建模方法构建休眠期结核分枝杆菌模型。取缺氧及缺钾模型诱导的休眠期结核菌菌液，将其分别随机分成5组，每组设3个复管，每支试管装2 mL菌液。再向各组试管中分别加入100 μL的异烟肼（终浓度5 μg/mL，异烟肼组）、利福平（终浓度5 μg/mL，利福平组）、噬菌体Leo（滴度2.6×108 PFU/mL，Leo组）、噬菌体Guo1（滴度3.26×108 PFU/mL，Guo1组），对照组加入等量ddH2O。利用最大可能数法，分别检测休眠期结核菌对异烟肼、利福平的耐药性及噬菌体对休眠期结核菌的裂解作用。 结果 噬菌体Guo1、Leo的卷尺蛋白中均含有motif3基序，且其motif3基序含6个高度保守的氨基酸殘基、1个高度保守的异亮氨酸-色氨酸位点。当作用于缺氧模型休眠期结核菌时，与利福平组、异烟肼组较较，Guo1组菌量明显减少（P < 0.05）;当作用于缺钾模型休眠期结核菌时，与利福平组比较，Leo组菌量明显减少（P < 0.05）。缺钾模型对异烟肼、利福平的耐药率明显高于缺氧模型。结论 相较于缺氧模型，缺钾模型能诱导结核菌进入更深的休眠状态。噬菌体Guo1对缺氧模型诱导的休眠期结核菌有裂解作用，噬菌体Leo对缺钾模型诱导的休眠期结核菌有裂解作用。

[关键词] 噬菌体;休眠期结核菌;缺氧模型;缺钾模型;裂解作用

[中图分类号] R52          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）12（c）-0004-05

Lysis effect of phage Guo1 and Leo on Mycobacterium tuberculosis in the dormant stage of different models

JIANG Lisha1，2   GUO Shuliang1

1.Department of Respiratory and Critical Care Medicine， the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing   400016， China; 2.Department of Respiratory Medicine， the First Branch， the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University， Chongqing   400016， China

[Abstract] Objective To investigate the lysis effect of phage Guo1 and Leo on Mycobacterium tuberculosis in dormant stage. Methods ClustalX software was used for multiple sequence comparison. Motif3 motifs of phage Guo1 and Leo were searched. The model of Mycobacterium tuberculosis in dormant stage was constructed by hypoxia model and potassium deficiency model respectively. Hypoxic and potassium deficiency mode induce domant TB bacterial fluid， they were respectively randomly divided into 5 groups， each group was set with 3 duplicate tubes， and each tube was filled with 2 mL bacterial liquid. Then 100 liters of Isoniazid （final concentration： 5 g/mL， Isoniazid group）， Rifampicin （final concentration： 5 g/mL， Rifampicin group）， phage Leo （titer： 2.6×108 PFU/mL， Leo group）， and phage Guo1 （titer： 3.26×108 PFU/mL， Guo1 group） were added to the test tubes of each group， and the control group was added with the same amount of ddH2O. The drug resistance to Isoniazid and Rifampicin in dormant tuberculosis bacteria and the lysis of phage in dormant Tuberculosis bacteria were detected by most probable number method. Results The motif3 motif was found in the tape rule proteins of phages Guo1 and Leo， and the motif3 motif contained 6 highly conserved amino acid residues and 1 highly conserved isoleucine-tryptophan site. When used as hypoxia model for dormant Tuberculosis bacteria， compared with Rifampin group and Isoniazid group， the bacteria quantity of Guo1 group decreased significantly （P < 0.05）. Compared with Rifampicin group， the amount of bacteria in Leo group decreased significantly （P < 0.05）. The drug resistance rate of potassium deficiency model to Isoniazid and Rifampicin was significantly higher than that of hypoxia model. Conclusion Compared with hypoxia model， potassium deficiency model can induce Tuberculosis bacterium to enter deeper dormant state. Phage Guo1 has cleavage effect on dormant tuberculosis bacteria induced by hypoxia model， and phage Leo has cleavage effect on dormant Tuberculosis bacteria induced by potassium deficiency model.

[Key words] Mycobacteriophage; Mycobacterium tuberculosis; Oxygen-deficient model; Potassium-deficient model; Lysis effect

结核病病程迁延，易复发，其中内源性复发占绝大部分，而导致内源性复发的关键因素是休眠期结核分枝杆菌。结核分枝杆菌在不利环境下会进入休眠状态，休眠期结核分枝杆菌能长期潜伏，逃避机体的免疫杀伤，对经典抗结核药物耐药。当机体免疫力下降时，休眠期结核菌又重新复苏，发展成为活动性结核病，所以休眠期结核菌是结核病复发的根源。相关学者[1-2]发现卷尺蛋白中含有motif3基序的噬菌体能够识别、感染休眠期结核菌。因此有望找到能裂解休眠期结核菌的噬菌体，为结核病治疗提供新思路。

休眠期结核菌的建模方法各异，现已报道了缺氧模型[3]、饥饿模型[4]、酸化模型[5]、多因素模型[6]、维生素C诱导模型[7]、结核肉芽肿模型[8]、缺钾模型[9]等多种休眠期结核菌体外模型，却各有优缺点。其中，缺氧模型由Wayne等[3]于1996年建立，是目前研究最透彻、应用最广泛的模型。缺钾模型由Salina等[9]于2014年建立，它能诱导出对超高浓度（10、50 μg/mL）利福平表型耐药的结核菌。但目前国内尚无利用两种模型同时构建休眠期结核菌，并对其诱导表型耐药作对比研究的报道。本研究拟寻找候选噬菌体，并验证其对缺氧模型及缺钾模型两种不同模型诱导的休眠期结核菌的裂解作用。

1 材料与方法

1.1 菌种

结核分枝杆菌标准株H37Rv（CMCC93004）由重庆市胸科医院惠赠，将其接种于中性罗氏培养基（珠海贝索）中培养4～6周后用于后续实验。分枝杆菌噬菌体Leo由加拿大拉瓦尔大学Félix d′Hérelle噬菌体中心惠赠，分枝杆菌噬菌体Guo1由重庆医科大学附属第一医院传染病病原学实验室自行分离。

1.2 motif3基序生物信息学分析

利用ClustalX软件，比较TM4 motif3基序及Guo1、Leo的卷尺蛋白，并进行多重序列对比，搜索Guo1、Leo的motif3基序。

1.3 构建休眠期结核菌模型

1.3.1 缺氧模型构建  参考文献[3]，略有改动，取结核分枝杆菌于7H9液体培养基（BD，美国，含0.2%甘油、10% ADC及0.05% Tween80）中37℃震荡培养10～15 d。取15 mL试管，向内加入10 mL 7H9液体培养基;再取对数生长期的结核分枝杆菌菌液（OD595 0.4～0.6），研磨均匀，按1∶100的比例加入7H9液体培养基中，然后加入亚甲蓝溶液（终浓度1.5 μg/mL），用橡胶塞及密封膜封闭试管口，置于37℃恒温箱中静止培养。结核分枝杆菌密闭培养15 d后，亚甲蓝变为无色，亚甲蓝作为无氧指示剂，变为无色时提示试管内进入完全缺氧状态。将结核分枝杆菌密闭培养1年以上。一般来说，缺氧环境下培养超过1年的结核分枝杆菌可看作进入休眠状态[10]。

1.3.2 缺钾模型构建  参考文献[9]，取结核分枝杆菌菌落，转种于苏通培养基（含10% ADC和0.05% Tween 80）内，37℃震荡培养10～15 d。将菌液离心（10 000 r/min），弃上清液，保留沉淀，按上述步骤，用ddH2O重复洗涤2次、保留沉淀，再用缺钾苏通培养基（含10% ADC和0.05% Tween 80）重悬所得细菌沉淀，37℃震荡培养35 d。苏通培养基成分（1 L，调节pH 7.0）：KH2PO4 0.5 g，MgSO4·7H2O 1.4 g，L-asparagine 4 g，甘油60 mL，枸橼酸铁铵0.05 g，柠檬酸钠2 g，1% ZnSO4·7H2O液0.1 mL。缺钾苏通培养基成分（1 L，调节pH 7.0）：Na2HPO4·12H2O 8.9 g，MgSO4·7H2O 1.4 g，L-asparagine 4 g，甘油60 mL，枸橼酸铁铵0.05 g，柠檬酸钠2 g，1% ZnSO4·7H2O液0.1 mL。

1.4 休眠菌模型耐药性检测及噬菌体对休眠菌杀菌作用

1.4.1 缺氧模型  参考文献[9]，取缺氧模型诱导的休眠期结核菌菌液，研磨均匀，随机分成5个组，每组设3个复管，每支试管裝2 mL菌液。再向各组试管中分别加入100 μL的异烟肼（终浓度5 μg/mL）、利福平（终浓度5 μg/mL）、噬菌体Leo（滴度2.6×108 PFU/mL）、噬菌体Guo1（滴度3.26×108 PFU/mL），对照组加入等量ddH2O。将所有试管置于恒温振荡器（37℃ 160 r/min）中振荡培养7 d。随后，取各试管中菌悬液，研磨均匀，用全营养的苏通培养基10倍梯度稀释，加入48孔板中行最大可能数（MPN）法计数（每个稀释度有3个复孔）测细菌浓度，将48孔板置于37℃恒温箱内静止培养15 d。再按3∶20的比例，向48孔板的各孔内加入0.02%刃天青溶液进行显色，7 d后观察显色结果。刃天青显色原理：蓝色提示无活菌生长，变为红色提示有活菌生长。根据观察结果，利用MPN法计数原理计算MPN值，从而推算出细菌浓度，MPN值的计算采用标准的统计方法[11]。

1.4.2 缺钾模型  方法同前述缺氧模型实验。

1.5 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件对数据进行统计分析。缺氧模型实验结果，取细菌浓度对数值，采用两独立样本t检验。缺钾模型实验结果，取细菌浓度值，采用秩和检验，以P < 0.05表示差异有统计学意义。耐药率计算方法[3，16]：耐药率=药物组菌浓度平均值/对照组菌浓度平均值×100%。

2结果

2.1 噬菌体motif3基序

在噬菌體Leo和Guo1的卷尺蛋白中分别找到其motif3基序（表1、图1）。同时发现Leo和Guo1的motif3基序中含有6个高度保守的氨基酸残基（甘氨酸、天门冬氨酸、脯氨酸、天门冬氨酸、2个组氨酸残基）和1个高度保守的异亮氨酸-色氨酸位点（图1）。

2.2 缺氧模型耐药性检测及噬菌体对休眠期结核菌的裂解作用

与对照组比较，异烟肼组和利福平组，结核分枝杆菌量减少了1～2个数量级，差异有统计学意义（P < 0.05），提示仅部分结核分枝杆菌出现表型耐药。但异烟肼组和利福平组仍有105个结核分枝杆菌存活，该部分结核分枝杆菌已出现表型耐药，进入休眠状态。噬菌体Leo组菌量大于异烟肼组和利福平组，则噬菌体Leo对缺氧模型诱导的休眠期结核菌无裂解作用。Guo1组相较于异烟肼和利福平组，细菌量减少了3个数量级以上，差异有统计学意义（P < 0.05），提示噬菌体Guo1对缺氧模型诱导的休眠期结核菌有明显裂解作用。见图2。

2.3 缺钾模型耐药性检测及噬菌体对休眠期结核菌的裂解作用

利福平组、异烟肼组与对照组菌量比较，差异无统计学意义（P > 0.05），显示所有结核菌出现表型耐药，进入休眠状态。Guo1组与异烟肼组及利福平组菌量比较，差异无统计学意义（P > 0.05），则噬菌体Guo1对缺钾模型诱导的休眠期结核菌无裂解作用。而Leo组菌量为零，与利福平组比较，差异有统计学意义（P < 0.05），则噬菌体Leo能完全杀灭缺钾模型诱导的休眠期结核菌。见图3。

2.4 结核休眠菌耐药率结果

缺钾模型诱导的休眠期结核菌，其对异烟肼及利福平的耐药率明显高于缺氧模型。见表2。

3 讨论

世界上有23%的人口都有潜伏结核感染[12-13]，此时结核分枝杆菌在患者体内处于休眠状态，对经典抗结核化疗药物耐药，使结核病迁延不愈。因此亟需找到能杀灭休眠期结核菌的新药物。

噬菌体对耐药结核病的治疗，已成功应用于豚鼠模型[14]。但结核分枝杆菌进入休眠状态后，会出现细胞壁增厚、交联增加（透光度降低）的现象[15-16]。细胞壁增厚会增加噬菌体感染结核分枝杆菌的难度，而motif3基序则赋予噬菌体感染休眠期结核菌的能力[1]。不含motif3基序的噬菌体D29、Che12对休眠期结核菌的感染能力明显弱于含motif3基序的噬菌体TM4[2]。迄今发现含motif3基序的噬菌体，其卷尺蛋白氨基酸含量在1100～1900 aa之间[2]，而卷尺蛋白氨基酸含量与噬菌体尾部长度成正比关系[17]，推测含motif3基序的噬菌体为长尾噬菌体。噬菌体Guo1（未发表）和噬菌体Leo[18]均为长尾噬菌体。Dusthackeer等[2]发现在motif3基序中含有6个高度保守的氨基酸残基（甘氨酸、天门冬氨酸、脯氨酸、天门冬氨酸、两个组氨酸残基）和1个高度保守的异亮氨酸-色氨酸位点。噬菌体TM4 motif3基序中异亮氨酸-色氨酸位点的突变，可导致其对休眠期耻垢分枝杆菌的感染能力下降50%[1]。经软件分析，噬菌体Leo、Guo1的卷尺蛋白中含motif3基序，且motif3基序中的6个高度保守氨基酸残基和高度保守位点均未缺失，推测其对休眠期结核菌具有裂解作用。噬菌体Guo1为本实验室自主分离，对其研究有利于后续专利的申请。

休眠期结核菌具有对异烟肼、利福平耐药的特点，这种耐药变异是由于细菌停止生长引起的，并未出现基因水平的改变，称为表型耐药[19-20]。结核分枝杆菌根据生长状态不同分为：活跃期、静止期（休眠早期）、完全休眠期。异烟肼主要对活跃期结核菌有杀菌作用，而利福平对静止期结核菌亦有杀菌作用。如果对利福平耐药，提示结核菌进入更深的休眠状态[6]。实验发现，缺钾模型诱导的休眠期结核菌，耐药率明显高于缺氧模型，特别是对5 μg/mL利福平的耐药率达100%，是缺氧模型的100倍，建模时间仅为缺氧模型的1/10。据报道，多因素模型建模18 d诱导出的休眠期结核菌，对5 μg/mL利福平的耐药率仅11%[6];即使建模30 d，对1 μg/mL利福平耐药率仅9.72%[16]。相较上述两种模型，缺钾模型能在短时间内诱导结核分枝杆菌进入更深的休眠状态，具有明显的优势。

本研究显示，噬菌体Guo1对缺氧模型休眠期结核菌有明显裂解作用，而对缺钾模型休眠期结核菌无裂解作用;噬菌体Leo对缺钾模型休眠期结核菌有裂解作用，而对缺氧模型休眠期结核菌无裂解作用。推测这种现象可能与两种模型所诱导的休眠期结核菌所处生长状态不同有关。缺氧模型诱导的休眠期结核菌中静止期菌占绝大部分，而缺钾模型可诱导出对超高浓度利福平（50 μg/mL）耐药的休眠期结核菌[9]，则其中完全休眠期菌占绝大部分。分析本研究结果，则Leo对完全休眠期结核菌有杀灭作用，而对静止期结核菌杀灭作用弱;Guo1对静止期结核菌有杀灭作用，对完全休眠期结核菌杀灭作用弱。解决这一问题的最好方法就是将这两种噬菌体混合制成“鸡尾酒制剂”，优势互补，同时还能解决单一噬菌体长期应用易诱发耐药变异的问题[21]。

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（收稿日期：2019-09-12  本文编辑：封   华）