齐 心，梅纪坤，张 灿

(青岛农业大学动物医学院,山东 青岛266109)

随着水貂养殖业的发展,养殖规模也在不断扩大,水貂经过多年的人工驯化,长期处于不良饲养环境下,导致其抗病能力出现大幅度降低,一旦发病就会造成巨大的经济损失,这也是制约水貂养殖业发展的重要因素。绿脓杆菌又称为铜绿假单胞菌,广泛存在于自然界中,能够引起水貂出血性肺炎,严重危害水貂养殖业[1]。绿脓杆菌普遍存在较强耐药性,据报道其对第三代头孢菌素等的耐药率高达60%,急需开发新的抗生素替代品,用于绿脓杆菌病的防治[2]。

噬菌体是一种能够特异性侵染细菌的病毒,在自然界中广泛存在,影响着细菌的生态及进化[3]。根据噬菌体侵入和裂解细菌的特点,可将噬菌体分为溶源性噬菌体和烈性噬菌体[4]。烈性噬菌体通过识别宿主菌细胞表面受体吸附于细菌表面,进而快速裂解细菌,具有种属特异性强、不影响正常菌群、不受细菌耐药性影响的优点,具有作为抗生素替代品的潜在开发优势[5]。近年来,烈性噬菌体广泛应用于食品消毒和细菌病的预防和治疗[6-7]。

本试验用双层平板法分离得到了1 株绿脓杆菌噬菌体,测定了该噬菌体的形态和生物学特性,为进一步开发噬菌体制剂防治水貂绿脓杆菌病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料 27 株绿脓杆菌临床分离株由青岛农业大学微生物实验室保存。水貂粪便样本采集自青岛市胶州水貂养殖场。

1.2 方法

1.2.1 噬菌体的分离与纯化 水貂粪样加入500 mL LB 肉汤和27 株绿脓杆菌新鲜菌液各500 μL混匀,37 ℃过夜培养,增殖噬菌体。样品经过滤、离心、抽滤后,各取100 μL 滤液分别加入等量27 株绿脓杆菌菌液,双层平板法分离噬菌体[8]。用单斑法纯化分离到的噬菌体[9]。

1.2.2 噬菌体的电镜观察 参照马建伟等[9]报道的方法。取噬菌体增殖液滴于铜网上,2%磷钨酸(PTA)染色,干燥后,透射电子显微镜观察噬菌体形态。

1.2.3 噬菌体裂解谱的测定 根据王杰等[10]报道的点样法测定噬菌体的裂解谱。分别将27 株绿脓杆菌增殖液200 μL 均匀涂布于普通培养基平板,滴加噬菌体增殖液于平板,于37 ℃恒温培养箱中倒置培养6 h。

1.2.4 噬菌体效价测定 将噬菌体增殖液10 倍比稀释后,取100 μL 各稀释度的增殖液分别与等量的菌液混匀,用双层平板法进行噬菌体效价的测定。

1.2.5 噬菌体对温度、pH 值敏感性的测定 噬菌体增殖液分别加入不同pH 值(2 ～13)的LB 肉汤,37 ℃水浴分别作用1、2 h 和3 h,立即测定噬菌体效价,绘制噬菌体phage30 的pH 值稳定性曲线。100 μL 的噬菌体增殖液分别在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃和80 ℃水浴中作用20、40 min 和60 min,立即测定噬菌体效价,绘制噬菌体phage30 的热稳定性曲线。

1.2.6 噬菌体最佳感染复数测定 对噬菌体增殖液和对数期的宿主菌菌液进行计数。分别按照感染复数为0.001、0.01、0.1、1、10 和100 的比例混匀至LB 肉汤中,37 ℃振荡培养至摇清,双层平板法测定噬菌体效价。

1.2.7 噬菌体一步生长曲线测定 参照Zhang C等[11]报道测定噬菌体一步生长曲线,方法略有改动。按最佳感染复数比例混匀噬菌体增殖液和宿主菌菌液,37 ℃孵育5 min,13 000 r/min 离心30 s,LB 肉汤重复洗涤两次,弃上清。用LB 肉汤重悬沉淀,37 ℃震荡培养。在不同的时间点取200 μL 的增殖液,16 000 r/min 离心1 min,测噬菌体效价。绘制一步生长曲线。

2 结果

2.1 绿脓杆菌噬菌体的分离与纯化 通过双层平板法分离得到一株噬菌体,命名为phage30。纯化3代后,得到单一均匀圆形、清晰透明,边缘光滑,直径为1 ～2 mm 的噬菌斑(图1)。测得其效价为4.3×1010PFU/mL。

图1 噬菌体phage30 的噬菌斑形态

2.2 噬菌体的电镜观察 透射电镜观察phage30,由明显的头部和尾部构成。头部呈正二十面体,直径约60 nm,尾部长约180 nm,不可伸缩(图2)。按照国际病毒分类委员会分类标准,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。

图2 噬菌体phage30 的电镜形态

2.3 噬菌体裂解谱的测定 点样法测定噬菌体phage30 的裂解谱,结果表明,27 株绿脓杆菌中噬菌体phage30 能够裂解8 株绿脓杆菌,裂解率为29.63%(8/27)。

2.4 噬菌体敏感性的测定

2.4.1 噬菌体phage30 的pH 值稳定性测定 试验测定得到的phage30 的pH 值稳定性曲线,见图3。由图3 可知,当pH 值为5 ～11 时,噬菌体phage30效价基本保持不变；当pH 值＜5 或pH 值＞11 时,噬菌体phage30 的裂解活性迅速下降。另外,噬菌体phage30 在同一pH 值条件下作用时间对噬菌体的裂解活性影响不大。因此当pH 值为5 ～11 时,噬菌体活性稳定。

图3 噬菌体phage30 的pH 值稳定性

2.4.2 噬菌体phage30 热稳定性测定 试验测定得到的phage30 的热稳定性曲线,见图4。噬菌体phage30 在40 ℃条件下,其效价基本保持不变,维持在1010以上；当温度高于50 ℃时随着作用时间的增长,其效价明显呈数量级下降,裂解活性迅速减弱甚至失活。因此,当温度在40 ℃以下的时候,噬菌体phage30 活性保持较好。

图4 噬菌体phage30 的热稳定性

2.5 噬菌体最佳感染复数的测定 噬菌体phage30最佳感染复数测定结果见表1。由表1 可知,当MOI=0.01 时,噬菌体phage30 的效价最高达到2.3×1010PFU/mL。根据结果计算噬菌体phage30的最佳感染复数为0.01。

2.6 噬菌体一步生长曲线的测定 测定得到噬菌体phage30 的一步生长曲线见图5。由图5 可知,噬菌体phage30 的潜伏期约为60 min,爆发期约为120 min,裂解量约为156。

表1 噬菌体phage30 最佳感染复数的测定

图5 一步生长曲线

3 讨论

自然界中噬菌体的数量庞大可达1031,分布范围广[4]。由于细菌耐药性的广泛存在,噬菌体作为细菌的天敌,具有作为抗生素替代品的开发潜力,近年来备受关注[5]。

本研究成功筛选到1 株绿脓杆菌噬菌体对其形态及生物学特征进行了鉴定。电镜形态观察确定噬菌体phage30 由二十面体的头部和不可伸缩的尾部组成,属于有尾噬菌体目,长尾噬菌体科。噬菌体phage30 的最佳感染复数为0.01,表明噬菌体phage30 可以在较低浓度时有效裂解宿主菌,裂解性能高、杀菌效果好,这与徐彬等[12]报道的铜绿假单胞菌噬菌体D204 的最佳感染复数一致。不同的绿脓杆菌噬菌体其潜伏期、裂解量存在较大差异。郭棵棵等[13]分离到的绿脓杆菌噬菌体PaP6 的潜伏期为10 min,暴发期为50 min,裂解量为10；李亚辉等[14]分离的绿脓杆菌噬菌体PL39 的潜伏期为20 min,暴发期为5 min,裂解量为20。本试验分离到的绿脓杆菌噬菌体phage30 潜伏期为60 min,暴发期为120 min,裂解量为156。噬菌体的裂解量与其基因组特征密切相关。噬菌体基因组中tRNAs数量越多,越有利于噬菌体蛋白的转录和翻译,进而提高噬菌体的增殖效率,缩短潜伏期的时间[15]。噬菌体phage30 潜伏期较长,暴发期长,裂解量高的原因尚需做进一步基因组测序分析。

噬菌体对温度和pH 值的耐受力是衡量噬菌体稳定性的重要指标。本研究测定了噬菌体phage30对温度和pH 值的敏感性,发现其对温度和pH 值的耐受力都较强,这对环境中温度和pH 值的不可掌控性来说是很好的应对机制。水貂的最适养殖温度在20 ℃～35 ℃,使用酸性或碱性消毒剂净化貂舍可导致环境pH 值发生变化。本次分离到的噬菌体phage30 在pH 值5 ～11、温度40 ℃以下时其裂解活性基本保持不变,具有良好的环境适应能力。

噬菌体phage30 可专性裂解绿脓杆菌,具有宿主谱宽、裂解性能高、pH 值和热稳定性好的特征,有潜在的开发价值应用于绿脓杆菌病的防治。