郝帅 田武国 高博 何渝军 罗东林

[摘要] 乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，并且是癌症致死的主要原因。肿瘤在发生发展过程中会持续释放肿瘤细胞DNA入血，这些循环肿瘤DNA（ctDNA）携带肿瘤相关的基因突变信息，使其成为潜在的癌症生物标志物。ctDNA检测作为液体活检的一种，简单易行，能够以微创的方法动态监测肿瘤进展和治疗反应，在乳腺癌领域得到广泛研究，在疾病疗效监测、耐药识别、预测复发、判断预后等方面具有潜在的临床应用价值。

[关键词] 乳腺癌;循环肿瘤DNA;液体活检

[中图分类号] R473.73          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）07（c）-0043-04

Application Progress of circulating tumor DNA in the treatment of breast cancer

HAO Shuai   TIAN Wuguo   GAO Bo   HE Yujun   LUO Donglin

Department of Breast， Thyroid Surgery， Research Institute of Surgery， Daping Hospital， Army Military Medical University， Chongqing   400042， China

[Abstract] Breast cancer is one of the most common malignant tumors in women and the leading cause of death from cancer. Tumor cell DNA is continuously released into the blood during the development of tumor. These circulating tumor DNA （ctDNA） carry the information of tumor-related gene mutation， making it a potential cancer biomarker. As a kind of liquid biopsy， ctDNA detection is simple and easy， and can dynamically monitor tumor progression and treatment response with minimally invasive methods. It has been widely studied in the field of breast cancer， and has potential clinical application value in the aspects of disease efficacy monitoring， drug resistance identification， recurrence prediction and prognosis judgment.

[Key words] Breast cancer; Circulating tumor DNA; Liquid biopsy

早在1948年，Mandel等[1]发现血浆中存在游离的核酸分子，即细胞游离DNA（circulating cell-free DNA，cfDNA）。1977年，Leon等[2]发现癌症患者血浆中cfDNA的水平明显高于健康人群，Shapiro等[3]同样发现恶性肿瘤患者具有比良性疾病患者更高水平的cfDNA，这表明cfDNA可能与肿瘤相关。原发肿瘤组织、循环肿瘤细胞、其他组织中的微转移灶通过凋亡、坏死或直接分泌的方式释放进入循环系统，在人体血液中不断流动的携带一定特征（包括突变、缺少、插入、重排、拷贝数异常、甲基化等）的肿瘤基因组DNA片段称为循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）[4]。

ctDNA包含与原发实体肿瘤一致的基因变异特征，这一特点有助于鉴别肿瘤或正常细胞来源的DNA，因此ctDNA具有作为潜在的肿瘤标志物的价值[5]。与传统蛋白质类生物标志物比较，ctDNA具有更短的半衰期，这一特点使ctDNA能够反映肿瘤的最新动态信息，便于对肿瘤患者的病情进行实时监测[6]。

1 ctDNA检测技术

外周血中DNA含量极低[7]，因此高灵敏度的ctDNA检测方法至关重要。ctDNA检测主要包括以PCR和以二代测序（next-generation sequencing，NGS）技术为基础的方法，均有助于辨别cfDNA中少量携带肿瘤相关变异的片段，实现ctDNA的定量和定性检测[8]。

以PCR为基础的ctDNA检测技术适用于单个或数个基因位点的检测。1994年，历史上首次应用等位基因特异性PCR方法在胰腺癌患者血液中识别了KRAS突变[9]，该技术受限于较低的灵敏度，目前正被其他方法所取代。数字PCR（digital PCR，dPCR），微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）[10]以及BEAMing[11]等检测技术均成功应用于ctDNA的检测分析，上述方法可以检测到低至0.001%～0.010%的突变，尽管基于ddPCR的检测方法具有较高的灵敏度，但其检测范围仅局限于少量基因位点，严重限制了ctDNA研究的广度。

NGS技术能够避免这一局限性，其具有同时检测大规模体细胞DNA突变的能力，能够识别未知的突变[12]，在揭示基因组的复杂性和肿瘤异质性中具有独特优势。Chicard等[13]联合应用全外显子组测序（whole exome sequencing，WES）与深度覆盖靶向测序研究肿瘤的克隆异质性，并比较了实体肿瘤和cfDNA之间的体细胞突变和拷贝数改变。此外，Manier等[14]應用WES来对比CTCs、cfDNA和原发肿瘤的突变信息和拷贝数变异，获得了高度的一致性。近来，Newman等[15]设计了深度测序癌症个性化图谱（cancer personalized profiling by deep sequencing，CAPP-Seq）技术，其检测突变等位基因片段的敏感度低至0.02%，并且具有96%的特异性，该技术的相关研究已广泛开展[16]。无论是基于PCR或者NGS技术的检测方法，更广的检测范围和更高的灵敏度均有助于ctDNA检测在恶性肿瘤中的临床应用。

2 ctDNA在乳腺癌中的临床应用

乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，与传统组织活检比较，ctDNA检测能够提供更全面的肿瘤遗传学信息，并且具有简便易行、无创、可实时动态检测等优点，在乳腺癌领域得到广泛研究，在肿瘤负荷监测、疗效评估、预后分析等方面具有一定的临床价值[17]。

2.1 ctDNA与乳腺癌肿瘤负荷的监测及疗效评估

肿瘤负荷是指肿瘤对人体的危害程度，包括肿瘤的大小、活跃程度、转移情况。其监测主要依赖于影像学检查和蛋白质类生物学标志物的检测，然而上述方法均存在一定的局限性。ctDNA检测作为液体活检技术的一种，具有较好的灵敏度和特异度，并且ctDNA水平与肿瘤负荷直接相关。因此，通过ctDNA检测可以实现肿瘤负荷变化的监测，进而实时反映治疗的效果，指导治疗决策的制订[18]。

近年来，研究发现随着恶性肿瘤的进展，ctDNA的水平逐渐升高，而随着手术或化疗等治疗的开展，ctDNA会随之下降[19]。并且ctDNA具有更短的半衰期，能够更加迅速的评估肿瘤的动态变化。早在2008年，Diehl等[20]就发现，APC、KRAS、TP53、PIK3CA等基因突变的频率会随着治疗过程而变化，变化趋势与肿瘤负荷呈正相关。Dawson等[21]研究得出了相似的结论，治疗过程中ctDNA拷贝数变化曲线体现出与肿瘤负荷变化和治疗效果的一致性，提示ctDNA可用于监测肿瘤负荷的变化。Riva等[22]研究发现在乳腺癌新辅助治疗期间ctDNA水平迅速下降，而ctDNA水平下降缓慢的患者存活率相对较低，进一步表明ctDNA可以反映乳腺癌的治疗反应。

基因甲基化状态在肿瘤发生发展中同样发挥重要作用。Takahashi等[23]对87例乳腺癌化疗前、后血浆标本进行甲基化RASSF1基因检测，治疗有效患者的甲基化水平显著下降（P = 0.006）。Fiegl等[24]研究发现了类似的结论，表明ctDNA的RASSF1A甲基化检测能够监测治疗的疗效。Fackler等[25]开发了定量多元甲基化特异PCR技术，检测乳腺癌中较易发生甲基化的10个基因，发现病情稳定或者治疗有效患者的DNA甲基化程度显著降低，而疾病进展或无效的患者则相反。

因此，无论分期早晚，ctDNA的动态监测能够实时反映肿瘤负荷情况，进而反映治疗效果，对于协助临床诊断、指导临床决策具有重要意义。

2.2 ctDNA与乳腺癌基因型动态检测及耐药的识别

随着治疗的开展，癌细胞会发生克隆进化，失去和/或获得新的改变而发生演变，从而导致对以前有效的治疗产生抗药性[26]。因此在疾病治疗的全程动态检测肿瘤克隆基因组具有重要价值[27]。

ER阳性的晚期乳腺癌患者通过ctDNA检测能够发现ESR1突变，这是导致患者对芳香化酶抑制剂（aromatase inhibitor，AI）耐药的原因[28]。Schiavon等[29]研究证实了这一点，ESR1突变乳腺癌患者接受AI治疗后PFS明显短于血浆未检测到ESR1突变患者。多数接受抗HER-2靶向治疗的乳腺癌患者，会产生对曲妥珠单抗隆抗体的耐药，当前临床上尚无准确预测上述耐药的检测手段。Miller等[30]研究发现PIK3CA突变的存在可能是HER-2靶向药物较好反應的预测指标。此外，Maass等[31]发现存在PI3K基因突变的乳腺癌患者抗HER-2治疗效果较差，其完全缓解率仅为19%，而没有该基因突变的患者可以达到33%。Wang等[32]研究发现，通过ctDNA进行HER-2状态的检测与原发肿瘤HER-2状态具有很高的一致性，表明治疗过程中通过ctDNA检测HER-2拷贝数的变化能够筛查对曲妥珠单抗敏感的人群并监测疗效。2013年Nature杂志的一项研究揭示了ctDNA突变在探索乳腺癌继发性耐药机制中的价值，Murtaza等[33]在转移性乳腺癌患者中发现，紫杉醇治疗后ctDNA检出PIK3CA突变的频率升高并预示出现紫杉醇耐药。在另一项研究中，Murtaza等[34]对1例ER阳性、HER-2阳性转移性乳腺癌患者进行全外显子测序，发现PIK3CA（E542K）突变频率的升高与他莫昔芬联合曲妥珠单抗耐药相关，拉帕替尼耐药后患者血浆ERBB4（H809G）突变频率明显增高。

治疗过程中癌细胞会发生克隆进化，如果能及时识别基因改变状态，调整治疗方案，就能避免无效的治疗，使患者最大获益。

2.3 ctDNA与微小残留病灶的识别及预后的预测

复发是癌症治疗面临的主要难题之一，往往与治疗后肿瘤成分的残留，即微小残留病灶（minimal residual disease，MRD）有关。利用术后ctDNA特征突变是否检出、突变频率值或术前术后突变频率的变化，均可以作为MRD和预后的判断指标。

Garcia-Murillas等[35]通过动态检测乳腺癌治疗期间的ctDNA，发现在50%的复发患者中术后首次ctDNA检测即为阳性，并能平均早于临床影像学检查7.9个月预测复发转移的发生。Reinert等[36]研究进一步发现，在部分复发病例中，ctDNA突变频率增加并早于影像学和蛋白质标志物的变化，便于临床医生及时采取相应的治疗措施。

当前ctDNA预测预后潜能的研究多基于一个或数个突变位点，而特异性基因重排同样可用于MRD的识别，并且具有更大的潜力[37]。Harris等[38]基于NGS技术，通过癌症患者染色体重排的个性化特征，应用于预测转移、复发的发生。Olsson等[39]开展的研究旨在评价ctDNA监测乳腺癌早期复发转移的价值，与临床检查比较，在86%的患者中，ctDNA提前了平均11个月预测疾病的复发，术后ctDNA的检出预示着明显缩短的DFS，并且ctDNA的水平与患者OS相关。

MRD的检出情况有助于早期识别癌症患者的复发风险，以此来给患者分类，依据高危、低危复发风险安排最优的治疗，使患者最大获益。

3 結语

ctDNA检测由于实时、无创、灵活等特点，可以应用于乳腺癌诊治的各个阶段。当前以PCR或NGS为基础的检测技术的发展和进步，提高了ctDNA检测的敏感性，提供了更加全面精确的肿瘤遗传基因组学信息。然而，亟须更多的大规模、前瞻性研究来评估ctDNA在乳腺癌临床诊治中的价值，以期改善患者生存。

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