肖炜卓 张龙 王晓冬 张保荣

[摘要] 目的 分析慢性牙周炎龈下菌斑的转录组，探究龈下菌斑群落在慢性牙周炎发病过称中的变化。 方法 选取2017年1月～2018年1月在航空总医院口腔科诊断为慢性牙周炎并满足纳入条件的7例的龈下菌斑患者，提取相关RNA，进行微量RNA建库。应用高通量二代测序技术，对其宏转录组进行分析，观察相关菌群基因表达情况。 结果 慢性牙周炎龈下菌斑中，文氏密螺旋体的基因序列高度表达。与牙周炎发生关系密切的同源蛋白质家族中，最多的表达基因序列与细菌的翻译相关。而碳水化合物活性酶相关的基因表达中，表达最多的是碳水化合物相关結构域基因序列和糖苷水解酶基因序列。 结论 通过宏转录组的测序分析，了解慢性牙周患者龈下菌斑中不同细菌基因表达情况及相关细菌生理代谢的基因表达，从而对牙菌斑的致病性提出新的研究方法和意见，加深对菌斑致病性的理解。

[关键词] 慢性牙周炎;龈下菌斑;转录组;高通量测序

[中图分类号] R781          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）07（c）-0021-04

Macrotranscriptome analysis of subgingival plaque in patients with chronic periodontitis

XIAO Weizhuo1*   ZHANG Long2*   WANG Xiaodong3   ZHANG Baorong1，3

1.School of Stomatology， Weifang Medical University， Shandong Province， Weifang   261000， China; 2.Department of Stomatology， University of Chinese Academy of Sciences， Shenzhen Hospital， Guangdong Province， Shenzhen   518000， China; 3.Department of Stomatology， Aviation General Hospital， Beijing   100012， China

[Abstract] Objective To analyze the transcriptome of subgingival plaque in chronic periodontitis and explore the changes of subgingival plaque community in chronic periodontitis. Methods From January 2017 to January 2018， 7 cases of subgingival plaque patients diagnosed as chronic periodontitis in the Department of Stomatology of Aviation General Hospital and meeting the inclusion conditions were selected. Relevant RNA was extracted and trace RNA was used to build a database. High-throughput second-generation sequencing technology was used to analyze the macrotranscriptome and the gene expression of related bacteria was observed. Results In the subgingival plaque of chronic periodontitis， the gene sequence of Venn treponema was highly expressed. Among the homologous protein families closely related to periodontitis， the most expressed gene sequences were related to bacterial translation. Among the active carbohydrate enzyme-related genes， the most expressed ones were the sequences of carbohydrate related domain genes and glycoside hydrolytic enzyme genes. Conclusion Macrotranscriptome sequencing analysis is conducted to understand the gene expression of different bacteria in subgingival plaque of chronic periodontitis patients and the gene expression of related bacteria physiological metabolism， so as to propose new research methods and opinions on the pathogenicity of dental plaque， and deepen the understanding of the pathogenicity of plaque.

[Key words] Chronic periodontitis; Subgingival plaque; Transcriptome; High-throughput sequencing

牙周炎是由牙菌斑及其代谢产物引起牙周支持组织丧失的慢性炎症疾病，其发病率在80%～90%[1-2]。牙周炎的发生、发展与多种因素相关[3-5]，牙周组织破坏是由牙龈下生物膜中的致病性微生物群引起的[6-7]。

牙周炎发生发展过程中的大部分微生物很难培养或不能培养[8-9]，导致其基因表达分析还不够完善。因此，探究牙周炎病因的关键是对牙菌斑及其代谢产物在发病过程中的变化[10-11]。近年来，借助新一代DNA测序技术的宏转录学在牙周炎致病性的相关研究成为了热点[12-14]。本研究基于二代测序技术对慢性牙周炎患者龈下菌斑的宏转录组进行分析，从宏转录组学的角度对慢性牙周炎的病因进行探究。

1 材料与方法

1.1 主要仪器及试剂

1.1.1 主要仪器

RNeasy mini kit RNA提取试剂盒（QIAGEN公司，货号：74104）、Illumina HiSeqTM 2000（深圳华大，型号：SY-401-1001）、生物芯片扫描仪（安捷伦科技公司上海，型号：Agilent2100）、Hanks液（北京诺博莱德，货号：C0832）干冰若干、冰盒、高速离心机（Thermo scientific公司，型号：Sorvall Legend Micro 21R）、超净实验台（苏州净化设备仪器厂，型号：SW-CJ-1F）;50 bp marker（北京擎科新业生物技术有限公司，货号：TSJ050-500）;无水乙醇、氯仿等（天津外环化工厂）;dNTP mixture（TaKaRa公司，货号：4019）。

1.1.2 试剂调配

D-hank溶液调配及pH调节，见图1。

1.2 方法

选取2017年1月～2018年1月在航空总医院口腔科诊断为慢性牙周炎7例龈下菌斑患者，采样前进行牙周炎程度评估，如探诊深度、牙周袋深度（PD）、附着丧失程度（AL）、以及探针出血情况（BOP）等[15]。

纳入标准：25～60岁，诊断为慢性牙周炎并天然牙不少于16颗，每个象限都有天然牙，至少有1个位点牙周袋深度>6 mm;排除标准：3个月内有牙周治疗，服用抗生素药物，全身性疾病史（糖尿病等），在妊娠期及哺乳期等情况。

1.2.1 患者龈下菌斑样品的采集

将每个样品溶于1.0 mL调配好的D-hank溶液，分装到1.5 mL厌氧运输管内，立即进行-80℃冷冻，同时记录取样位点PD、AL和BOP[16]。具体记录标准见表1。

1.2.2 转录组测序前准备

采用RNA提取试剂盒进行总RNA的提取。见图2。

1.2.2.1 提取样品的RNA质量浓度测定  将提取后的RNA进行质量检测评估。提取RNA总量在0.2032～1.3759 μg，RIN值为2.2～2.9，总体符合RNA建库要求[17]。提示提取获得的RNA质量和良好，比较完整，降解少。符合转录组建库要求，可以按照此样本建库、取样、实验。见表2。

1.2.2.2 cDNA文库建立以及DNA合成  cDNA文库建立按照图3进行，将得到的cDNA产物进行PCR扩增。

1.2.3 高通量测序

与传统测序方法[19]比较，本研究是边合成边测序，一次性可以处理几百上千万的数据量，能够短时间内对所获得短序列拼接、测序。

2 结果

为了保证结果一致性，所有序列的比对均使用BLAST（version 2.2.21）软件对比到各个数据库来完成。主要数据库包括：非冗余蛋白数据库（nonredundant database，NR）[20]、碳水化合物利用相关酶类数据库（Carbohydrate-Active enzymes database，CAZy）[21]、同源聚簇蛋白数据库（cluster of orthologous groups of proteins，COG）[22]。

2.1 基于NR数据库比较

将基因序列（merge-unigene）通过BLAST软件NCBI的NR蛋白数据库，在慢性牙周炎患者龈下菌斑中主要细菌比例如圖4a（封四）所示。其中文氏螺旋体的RNA含量最高，大约为齿垢密螺旋体的3倍。

2.2 基于COG数据库的功能注释

将基因序列与COG蛋白库比较，并进行COG数据库的蛋白功能注释。经过数据库功能比对发现含量最丰富的是与细菌翻译相关的过程。而在RNA加工，染色质的结构核动力等方面的相关功能蛋白和序列基因却很少。见图4b（封四）。

2.3 基于CAZy功能库的功能注释

将merge-unigene对比分析到CAZy，发现merge-unigene最多的两类碳水化合物酶是碳水化合物结合结构域（43）和糖苷水解酶（34）。但是与多糖裂解酶相关的merge-unigene数量为0。

3 讨论

慢性牙周炎患者龈下菌斑转录组分析显示，在疾病活动期，文氏螺旋体的含量并不高，但其参与疾病的过程要高于齿垢密螺旋体。分析发现，文氏螺旋体具有其他细菌不具备的运动方式，它可以通过鞭毛利用能量来改变自己的运动轨迹，具备主动迁移的能力。可以协同其他可以产生强的致病因子以及组织破坏的微生物对牙周破坏部位进行迁移，加剧深部牙周组织的破坏，使牙周的微环境更有利于疾病的发生发展，这为治疗牙周疾病提出了新方向。

基于COG数据库的对比说明在慢性牙周炎患者的龈下菌斑群落中，微生物的翻译过程占据主导。所以要想改变慢性牙周炎疾病的发生发展过程，就需要从破坏菌斑中群落的能量代谢，机械性防御以及翻译构成，降低群落整体的活动性，从而阻止疾病的进展。

通过CAZy数据库比对发现慢性牙周炎患者的龈下菌斑群落中，群落对于单糖的水解利用会比较活跃，而对于多糖的利用，则缺乏相关性酶。成熟的菌斑群落必须依靠宿主口腔内的多糖酶将多糖水解为单糖或者双糖之后才能加以利用。因此，清洁牙周袋环境的内容物在进行牙周炎的系统综合治疗后尤为必要。

试验尝试进行微量建库，在样品量达不到常规建库要求的前提下，未采用通常意义上先扩增，分离纯化后再建库的方法。后续分析证明，微量建库的原则和方法同样适用于口腔复杂样本的处理和分析。

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