肖聪 张懿敏 孙圣荣

[摘要] 目的 研究華蟾素联用顺铂对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力、凋亡和细胞周期分布的影响。 方法 体外培养乳腺癌MDA-MB-231细胞。CCK-8法检测华蟾素联用顺铂对细胞活力的影响;划痕实验检测华蟾素联用顺铂对细胞迁移能力的影响;流式细胞术分析华蟾素联用顺铂对细胞凋亡率及细胞周期分布的影响。 结果 CCK-8结果显示，与对照组比较，华蟾素组、顺铂组及华蟾素+顺铂组细胞活力降低，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。划痕结果显示，与对照组比较，华蟾素+顺铂组迁移能力显著下降，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。流式结果显示，与对照组比较，华蟾素+顺铂组G1期比例显著增多且凋亡更加明显，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。 结论 华蟾素联用顺铂能协同抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞活力，可能与诱导细胞周期阻滞于G1期、抑制细胞迁移并促进细胞凋亡有关。

[关键词] 华蟾素;顺铂;乳腺癌;MDA-MB-231细胞

[中图分类号] R737.9          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）07（c）-0012-05

Effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability， apoptosis and cell cycle distribution of MDA-MB-231 cells

XIAO Cong*   ZHANG Yimin*   SUN Shengrong

Department of Breast and Thyroid Surgery， Renmin Hosptial of Wuhan University， Hubei Province， Wuhan   430060， China

[Abstract] Objective To study the effects of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability， apoptosis and cell cycle distribution of breast cancer MDA-MB-231 cells. Methods Breast cancer MDA-MB-231 cells were cultured in vitro. CCK-8 assay was used to detect the effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell viability. Scratch test was performed to detect the effect of cinobufacini combined with Cisplatin on cell migration. Flow cytometry was used to analyze the effects of cinobufacini combined with Cisplatin on the apoptosis rate and cell cycle distribution of breast cancer cells. Results CCK-8 results showed that compared with the control group， the cell viability in the cinobufacini group， the Cisplatin group and the cinobufacini+Cisplatin group was decreased， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. The scratch results showed that the migration ability of the cinobufacini+Cisplatin group was significantly decreased compared with the control group， the difference was highly statistically significant （P < 0.01）. Flow cytometry showed that compared with the control group， the proportion of G1 phase in the cinobufacini+Cisplatin group increased significantly and the apoptosis was more obvious， the differences were statistically significant （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion Cinobufacini combined with Cisplatin shows a synergic effect in inhibiting MDA-MB-231 cells， which may be related to the induction of cell cycle arrest at G1 phase， inhibition of cell migration and promotion of cell apoptosis.

[Key words] Cinobufacini; Cisplatin; Breast cancer; MDA-MB-231 cell

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，全世界每年发病人数高达167万例，严重威胁女性的身心健康[1-2]。化疗作为乳腺癌综合治疗中至关重要的一环，发挥着抑制癌症进展、延长生存时间等作用[3]。顺铂作为乳腺癌术后化疗的一线药物，近年来许多临床研究表明，铂类对于复发的晚期乳腺癌均有较好的客观缓解率[4-5]。但与其他化疗药类似，顺铂的不良反应表现为骨髓抑制、胃肠道反应、神经毒性、肾脏毒性等，在一定程度上限制了其临床应用[6]。因此寻求通过药物联用降低其使用剂量，从而减少其毒副作用是一种有效的解决手段[7]。华蟾素作为一种中药，具有活血化瘀、化结溃坚、利水消肿、清热解毒等功效[8-9]。本课题组前期的研究发现，华蟾素对乳腺癌MDA-MB-231细胞有明显的抑制作用[10]。徐晓武等[9]研究也发现，华蟾素能诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡，作用机制可能与Bax蛋白表达上调并向线粒体转位有关。由此可见，华蟾素确实能有效发挥抗乳腺癌作用。为了进一步探究华蟾素与传统化疗药物顺铂是否具有协同作用，本研究用华蟾素联合顺铂处理MDA-MB-231细胞，研究华蟾素联用顺铂对乳腺癌MDA-MB-231细胞活力、凋亡和细胞周期分布的影响，以期为华蟾素联合顺铂应用于临床乳腺癌患者的术后化疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌MDA-MB-231细胞购自中国科学院细胞库上海保藏中心，取5～10代细胞进行实验。华蟾素（安徽金蟾生化股份有限公司，批号：160904）;顺铂（Sigma公司，批号：1134357）;DMEM高糖培养基（Hyclone公司，批号：AC0220191）;胎牛血清（Gibco公司，批号：16000044）;1%双抗（杭州吉诺公司，批号：31800）;Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒（江苏凯基生物科技有限公司，批号：KGA107）;CCK-8试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：C0038）。自动酶标仪（型号：Tecan Sunrise，Austria）、流式细胞仪（型号：BD FACSCalibur，USA）均来自武汉大学人民医院中心实验室。

1.2 细胞培养

用含有10%新生胎牛血清和1%双抗的DMEM高糖型培养基培养MDA-MB-231细胞，培养条件为37℃、5%二氧化碳。取对数生长期细胞进行后续实验。

1.3 CCK-8实验

取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔5×103个，每组设3个复孔，培养24 h。对照组不进行处理。实验组分别为：①5、10、20、30、40 μg/mL的华蟾素组;②10、20、40、60、80 μmol/L的顺铂组;③不同浓度的华蟾素+顺铂组。继续培养24 h和48 h后，每孔加入100 μL CCK-8试剂和培养液的混合液（1∶9），避光孵育1 h后，在自动酶标仪450 nm波长处测吸光度值A，细胞活力=（A空白组-A处理组）/A空白组×100%。采用两药相互作用指数（coefficient of drug interaction，CDI）评价两药相互作用性质，CDI的计算公式：CDI=AB/（A×B）。AB为两药联合使用时与对照组吸光度值的比值，A或B为各药单独使用时与对照组吸光度值的比值;当CDI<1时，提示两药的相互作用为协同作用;当CDI=1时，提示两药的相互作用为相加作用;当CDI>1时，提示药物的相互作用为拮抗作用。

1.4 划痕实验

将MDA-MB-231细胞以每孔5×104个接种于12孔板中，待细胞长到完全融合后，用无菌100 μL枪头在12孔板每个孔底划出“十”字线，PBS洗涤2次，再用倒置显微镜拍照，然后在每个孔中加入无血清DMEM高糖培养基。对照组不进行处理。实验组分别为10 μg/mL华蟾素组、20 μmol/L顺铂组及华蟾素+顺铂组。继续培养48 h后用倒置显微镜观察划痕愈合度，拍照记录。

1.5 细胞周期流式分析

取对数生长期MDA-MB-231细胞接种于6孔板中，每孔5×105个，培养24 h至细胞贴壁。对照组不进行处理。实验组分别为10 μg/mL的华蟾素组、20 μmol/L顺铂组及华蟾素+顺铂组。继续培养24 h后，用胰酶消化并收集细胞，1500 r/min离心（r = 10 cm）5 min后，弃上清并用冷PBS洗涤2次，用预冷的75%乙醇固定过夜。检测前离心细胞，去掉乙醇，用PBS洗涤2次后，100 μL PBS重悬細胞后加入2 μL浓度为1 mg/mL的核糖核酸酶（RNaseA），37℃水浴40 min后，加入100 μL浓度为100 μg/mL的PI染色液，避光染色20 min后，用流式细胞仪检测细胞周期的改变。

1.6 细胞凋亡流式分析

同上法处理细胞，取加载结束后培养24 h的各组细胞，用不含乙二胺四乙酸（EDTA）的胰酶消化细胞并收集，1000 r/min离心（r = 10 cm）5 min后，弃去上清液后用冷PBS洗涤2次，加入500 μL binding buffer重悬细胞后，再加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，避光孵育20 min后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率的改变。

1.7 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件分析实验数据，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组比较使用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 华蟾素或顺铂单用对MDA-MB-231细胞活力的影响

CCK-8结果示：华蟾素浓度依赖性地抑制MDA-MB-231细胞活力，其中24 h时，20、30、40 μg/mL华蟾素组与对照组比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;48 h时，5、10、20、30、40 μg/mL华蟾素能显著抑制MDA-MB-231细胞活力（P < 0.05或P < 0.01）;顺铂同样能以浓度依赖性地方式抑制MDA-MB-231细胞的活力，其中24 h时，20、40、60、80 μg/mL顺铂组与对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）;48 h后，10、20、40、60、80 μg/mL顺铂组能显著抑制MDA-MB-231细胞的活力（P < 0.05或P < 0.01）。见图1。

2.2 华蟾素与顺铂单用或联用对MDA-MB-231细胞活力的影响

浓度分别为5、10、20、30、40 μg/mL的华蟾素组的细胞活力分别为（91.70±6.41）%、（88.77±2.60）%、（82.27±2.37）%、（73.37±0.71）%、（68.90±1.26）%。浓度分别为10、20、40、60、80 μmol/L的顺铂组的细胞活力分别为（93.87±3.38）%、（91.20±1.53）%、（62.83±4.00）%、（49.57±2.08）%、（48.77±0.95）%。华蟾素（5 μg/mL）+顺铂（10 μmol/L）组的细胞活力为（86.67±4.00）%，CDI为1.007，提示此浓度下，两药的相互作用为相加;华蟾素（10 μg/mL）+顺铂（20 μmol/L）组的细胞活力为（68.33±4.32）%，CDI为0.844，提示此浓度下，两药对乳腺癌的抑制具有协同作用;华蟾素（20 μg/mL）+顺铂（40 μmol/L）组的细胞活力为（40.03±3.51）%，CDI为0.774，华蟾素（30 μg/mL）+顺铂（60 μmol/L）组的细胞活力为（29.73±1.62）%，CDI为0.817，华蟾素（40 μg/mL）+顺铂（80 μmol/L）组的细胞活力为（21.43±1.24）%，CDI为0.745。

2.3 华蟾素与顺铂单用或联用对MDA-MB-231细胞迁移的影响

48 h后，对照组细胞生长明显，伤口愈合百分比为（67.2±3.7）%;华蟾素组和顺铂组愈合百分比分别为（53.8±2.4）%、（32.9±2.5）%，与对照组比较差异有高度统计学意义（P < 0.01）;华蟾素+顺铂组的细胞生长稀疏，愈合趋势缓慢，愈合百分比为（4.0±2.6）%，与其他三组比较差异均有高度统计学意义（P < 0.01）。见图2。

2.4 华蟾素与顺铂单用或联用对MDA-MB-231细胞周期的影响

细胞周期结果表明，MDA-MB-231细胞经顺铂处理24 h后与对照组比较，G1期细胞的比例显著增加，差异有统计学意义（P < 0.05），而S期细胞比例显著减少（P < 0.05）;华蟾素组G1期及S期细胞比例与对照组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）;而当华蟾素与顺铂联合用药时，处于G1期的细胞比例则进一步增加，与对照组及华蟾素组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），但与顺铂组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。同时华蟾素+顺铂组的S期细胞比例则进一步减少，与对照组及华蟾素组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），但与顺铂组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。四组G2期细胞比例比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见图3。

2.5 华蟾素与顺铂单用或联用对MDA-MB-231细胞凋亡的影响

细胞凋亡结果表明，与对照组比较，华蟾素组和顺铂组均能显著促使MDA-MB-231细胞发生凋亡，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01），华蟾素+顺鉑组的促凋亡作用更显著，与对照组、华蟾素组和顺铂组比较，差异有统计学意义（P < 0.05或P < 0.01）。见图4。

3 讨论

华蟾素是中华大蟾蜍或黑框蟾蜍的全皮经提取加工制成的水溶性制剂，我国传统医学认为华蟾素具有活血化瘀、化结溃坚等功效[11-12]。此外，国内外众多学者的研究也表明，华蟾素对肝癌、结直肠癌、卵巢癌和食管癌等肿瘤具有抑制作用[13-16]。由于华蟾素具有广泛的抗肿瘤效应，能抑制肿瘤生长，目前已广泛用于临床上肝癌、肺癌、食管癌和胃癌等肿瘤患者的综合治疗，可改善患者的生存质量[17-18]。中药毒副作用小，并能减轻放化疗引起的毒副作用，增强化疗药物的杀伤作用[19-20]，因此华蟾素联用化疗药成为热门研究。尹宜海等[21]研究提示，华蟾素与三氧化二砷联用具有协同抑制结肠癌细胞的作用，机制可能与p27、Bax蛋白上调和Bcl-2蛋白下调有关，说明华蟾素联用化疗药能彼此发挥协同作用，从而达到抑制肿瘤的作用。

华蟾素作为一种新型的抗癌药物，在卵巢癌和骨肉瘤等实体瘤中已证实其与顺铂联用具有协同作用，可达到显著抑制癌细胞的目的[22-23]，然而在乳腺癌的研究中，这两药的相互作用却鲜有报道，因此本研究着力于探究在乳腺癌中，华蟾素与顺铂联用是否能协同抑制乳腺癌。本研究提示，华蟾素与顺铂均能浓度依赖性地抑制MDA-MB-231细胞活力，当10 μg/mL华蟾素联用20 μmol/L顺铂时，在抑制乳腺癌细胞的过程中发挥协同作用[24]，但随着药物浓度的增加，协同作用并未发生显著提升，提示华蟾素联用顺铂能在较低浓度下发挥协同作用，并且不随浓度的增加而增加。随后，本研究分析了华蟾素与顺铂单用或联用对细胞周期分布的影响，结果提示，华蟾素或顺铂单用时，均能导致G1期细胞比例增加，两者联用时，G1期细胞比例则进一步显著增加，说明华蟾素或顺铂单用均能导致细胞周期阻滞于G1期，两药联用时，则使这种阻滞效果更加明显。细胞凋亡结果提示，华蟾素或顺铂单用时均能诱导乳腺癌细胞凋亡，当两者联合应用时，凋亡细胞比例则进一步显著增加，说明两药联合应用比单一用药诱导肿瘤细胞凋亡作用更加显著。

本研究初步证实华蟾素与顺铂具有协同抑制MDA-MB-231细胞的作用，可能与协同诱导乳腺癌MDA-MB-231细胞周期阻滞于G1期、抑制迁移及促进其凋亡有关，本研究将进一步深入展开研究华蟾素联用顺铂抑制乳腺癌的分子机制，为华蟾素联合顺铂用于临床乳腺癌患者的治疗提供参考。

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