刘珍妮，李明慧，骆 钰，刘秉珲，黄诗杭，吴宝成,2，黄一帆,2*，吴异健,2*

(1.福建农林大学动物科学学院，福建福州350002；2.福建省兽医中药与动物保健重点实验室，福建福州350002)

循环中淋巴细胞选择性穿越高内皮微静脉(High endothelial venule，HEV，又称毛细血管后微静脉)定向游动称为淋巴细胞归巢，包括淋巴干细胞向中枢淋巴细胞器官归巢，成熟淋巴细胞向外周淋巴器官归巢[1]。通过淋巴细胞的归巢，可以使黏膜局部的免疫效应细胞游走到全身各处，进而使得局部免疫接种可以广泛引发其它黏膜组织免疫应答[2]。而整合素是介导淋巴细胞向肠黏膜迁移的重要分子[3]。整合素是一种膜镶嵌卵白，由α 和β 亚基连接形成异二聚体，α4 整合素包括α4β1 和α4β7 两种[4]。前者主要介导淋巴细胞向发生炎症的部位聚集和迁移，从而参与多种病理反应。后者主要在黏膜中淋巴细胞、NK 细胞和嗜酸性粒细胞中表达，与黏膜地址素黏附分子(Mucosal Addressin cell adhesion Molecule-1，MAdCAM-1)相互作用，介导淋巴细胞的归巢并参与该过程中的免疫应答。

番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus，MDRV)感染能够引起番鸭机体的免疫抑制，并破坏番鸭肠道形态结构和黏膜免疫功能，对番鸭养殖业造成严重损失[5]。本实验室前期研究表明MDRV 感染引起的雏番鸭肠的形态结构和黏膜免疫功能的损伤与淋巴细胞归巢有关[6-7]，本研究拟通过对整合素的示踪进一步探明MDRV 感染对淋巴细胞归巢的影响及其机制。目前国内关于番鸭整合素α4 的相关研究相对较少，尚无番鸭整合素α4 的商品化抗体，为此本实验在原核表达番鸭整合素α4 亚基的基础上制备抗体，并通过western blot 方法及间接免疫荧光(IFA)组化检测方法对MDRV 感染番鸭淋巴细胞后α4 蛋白表达水平及定位的变化进行分析，为开展α4 蛋白的功能和调控机制研究，以及为抗病毒新策略研究等奠定基础。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 MDRV 为本实验室分离鉴定[8]；pET-32a(+)原核表达载体由本实验室保存；大肠杆菌DH5α 和BL21 (DE3)感受态细胞购自TransGen Biotech；健康成年的福建黄兔购自福建农林大学兔园；MDRV 抗原抗体双阴性健康雏番鸭购自福建莆田温室鸭场。

1.2 主要试剂 反转录试剂盒购自Promega 公司；胶回收试剂盒(Gel Extraction Kit)和质粒小提试剂盒(Plasmid Mini Kit)购自Omega 公司；2×EsTaqMaster Mix、EcoRⅠ和SalⅠ购自TaKaRa 公司；RNA提取试剂盒(TransZol Up Plus RNA Kit)、T4 DNA 连接酶、蛋白Marker (Blue Plus Protein Marker)、ProteinIso Ni NTA Resin 蛋白纯化系统、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、PE 标记的山羊抗兔IgG、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔IgG (IgG-HRP)和山羊抗鼠IgG-HRP、Anti-His Mouse MAb 购自TransGen Biotech；外周血淋巴细胞分离液试剂盒购自天津市灏洋生物制品科技有限责任公司；σA 抗体为本实验室制备[9]；羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)购自北京索莱宝科技有限公司；PE 标记山羊抗兔IgG 二抗购自武汉艾美捷科技有限公司；4',6- 二脒基-2- 苯基吲哚(DAPI)购自北京中科瑞泰生物科技有限公司。

1.3 引物的设计与合成 根据α4 基因序列(XM027461081)，选择750 bp (928 bp～1 677 bp)α4亚基片段基因设计1 对特异性引物，α4F：5'-CCGG AATTCATGCTAAGTACCATCAGAGAGGA-3' (EcoRⅠ)/α4R： 5'-ACGCGTCGACTTATGCTTCAACATGT ATAGGAG-3' (SalⅠ)；设计1 对pET-32a(+)原核表达载体的特异性检测引物P6，P6F：5'-CGACGAC AAGGCCATGGCTG-3'/P6R： 5'-TTAGCAGCCGGAT CTCAGTG-3'。引物均由上海尚亚生物公司合成。

1.4 重组表达质粒的构建及重组蛋白的表达 无菌条件下解剖健康番鸭，采集十二指肠作为样本，按照试剂盒操作提取总RNA，反转录合成cDNA。以该cDNA 为模板，PCR 扩增α4 亚基的部分编码序列。PCR 反应体系为：2×PCRTaqMix 酶12.5 μL，α4F 和α4R 引物各1 μL，cDNA 模板2 μL，DEPC水补至25 μL。PCR 反应条件为：95 ℃5 min；95 ℃30 s、58 ℃30 s、72 ℃1 min，32 个循环；72 ℃10 min。PCR 产物经1 %凝胶糖凝胶电泳检测并切胶回收α4 亚基目的片段，预期扩增产物750 bp。目的片段经EcoRⅠ/SalⅠ双酶切后克隆至pET-32a(+)载体，构建重组质粒pET-His-α4。重组质粒经PCR鉴定后经测序鉴定。

将pET-His-α4 转化BL21，加IPTG 至终浓度为1 mmol/L，37 ℃诱导2 h 后离心收集菌体，加1×protein Buffer 充分混匀，煮沸10 min，冰上冷却2 min，4 ℃，12 000 r/min 离心2 min，取上清进行SDS-PAGE 分析。另取适量诱导后的菌超声波破碎，离心，以Anti-His Mouse MAb 为一抗(1∶4 000)，山羊抗鼠IgG-HRP 为二抗(1∶8 000)，进行western blot鉴定。利用Ni2+柱对表达重组蛋白进行纯化，测定浓度后-80 ℃保存。纯化的重组蛋白命名为rHis-α4。

1.5 多克隆抗体制备及效价测定 首免前，兔耳缘静脉采血分离血清作为阴性血清备用。将纯化的rHis-α4 与弗氏完全佐剂等体积充分乳化后，背部皮下多点注射福建黄兔(1.0 mg/ 只)，2 周后改用弗氏不完全佐剂乳化该重组蛋白质(1.0 mg/ 只)，每隔2周免疫一次，免疫3 次，心脏采血、分离血清。利用碳酸盐缓冲液稀释的rHis-α4 蛋白(20 μg/mL)包被酶标板，以免疫前的兔血清为阴性血清，取1∶500～1∶512 000 经2 倍倍比稀释的抗rHis-α4 的多克隆抗体为一抗，以山羊抗兔IgG-HRP (1∶1 000)为二抗，TMB 为底物显色，间接ELISA 方法检测多克隆抗体的效价，以待检血清孔的OD450nm值/ 阴性血清孔的OD450nm值≥2.1 判为阳性。设置rHis-α4 为500μg/mL，加于中央孔，40 μL/ 孔。其它孔加入2 倍倍比稀释的上述制备的兔阳性血清，并设置阴性血清对照。采用琼脂双向扩散法检测该多克隆抗体效价。

1.6 MDRV 感染后的体外番鸭淋巴细胞整合素α4表达水平的检测 取MDRV 抗原抗体双阴性雏番鸭心脏采血10 mL～20 mL，按照鸭外周血淋巴细胞分离试剂盒操作，从番鸭的血液中分离淋巴细胞，调整细胞密度至107个/mL 备用。将MDRV 接种于分离的淋巴细胞，分别于接种病毒后3 h、6 h、9 h、12 h、24 h 和48 h 收样。提取细胞蛋白经SDSPAGE 电泳、转印、封闭，以制备的抗rHis-α4 兔源多克隆抗体为一抗(1∶4 000)，山羊抗兔IgG-HRP 为二抗(1∶8 000)，进行western blot 鉴定，利用Image J软件分析蛋白的灰度值，计算出α4/β-actin 的值，所有数据用平均值±标准差表示。用SPSS11.5 软件进行数据统计分析，采用单因素方差进行差异显著性分析，LSD 法比较差异显著性。

1.7 MDRV 感染对雏番鸭淋巴细胞归巢至盲肠肠道黏膜影响的IFA 鉴定 将6 只1 日龄番鸭随机分为空白对照组(MOCK 组)和MDRV 感染组(MDRV组)，每组3 只。利用活细胞染料CFSE 标记分离的番鸭淋巴细胞，经台盼蓝染色法确定淋巴细胞活性大于95 %后，按番鸭每克体重2×105个淋巴细胞的比例通过番鸭肱静脉注射入番鸭体内。MDRV 感染组番鸭腿部肌肉注射MDRV。接种病毒后两组独立饲养，自由饮水采食。MDRV 感染第6 d，取空白组和MDRV 感染组番鸭的末端盲肠组织，制备切片，以本实验制备的抗rHis-α4 兔源多克隆抗体(1∶100)为一抗，以PE 标记的山羊抗免IgG 为二抗(1∶1 000)，室温避光静置，PBS 洗涤，DAPI 避光染色5 min，PBS 洗涤，甘油封片(避光，滴加防淬灭剂)，在共聚焦显微镜下观察。以IFA 方法检测MDRV 对雏番鸭盲肠中α4 蛋白的表达和淋巴细胞归巢的影响。

2 结 果

2.1 重组表达载体pET-His-α4 的构建与鉴定 以番鸭肠道组织cDNA 为模板，α4F/α4R 为引物，扩增得到约750 bp 的α4 特异性片段(图1A)，将其克隆至pET-32a(+)构建重组表达质粒pET-His-α4，用质粒引物P6F/P6R 进行PCR 检测，结果显示扩增得到约900 bp 的pET-His-α4 PCR 产物(α4 片段750 bp和质粒部分片段150 bp)，与预期相符(图1B)。重组质粒测序结果显示目的基因插入位置、序列和读码框正确，表明重组表达质粒pET-His-α4 正确构建。

2.2 重组蛋白的表达、纯化与鉴定结果 将pET-His-α4 转化大肠杆菌BL21 (DE3)宿主菌，加入IPTG 诱导后，SDS-PAGE 结果显示表达出了一条约45 ku 的蛋白条带(His 和α4 的融合蛋白)。经纯化后的蛋白浓度约为1.3 mg/mL。Western blot 检测结果显示，在45 ku 处出现一条蛋白条带，与预期一致(图2)，表明目的融合蛋白正确表达。

2.3 抗rHis-α4 多克隆抗体的制备及效价检测实验兔经基础免疫和加强免疫后，耳缘静脉采血，收集血清，以纯化的rHis-α4 蛋白为抗原，采用常规的间接ELISA 法测定制备的α4 兔多克隆抗体血清效价，当兔多克隆抗体稀释512 000 倍时，P/N≥2.1，结果显示其效价大于1∶512 000，琼脂结果显示，免疫血清抗体的琼扩效价达1∶32 (图3)。间接ELISA 和琼脂双向扩散试验结果表明本实验制备的α4 兔多克隆抗体具备较高的效价，目的蛋白有良好的免疫原性。

图1 整合素α4 亚基载体pET-His-α4 的构建及鉴定Fig.1 Construction and identification of pET-His-α4

图2 rHis-α4 蛋白纯化结果的SDS-PAGE(A)和western blot(B)分析Fig.2 SDS-PAGE (A)and western blot analysis (B)of the purified rHis-α4

2.4 MDRV 感染对体外番鸭淋巴细胞表达α4 蛋白水平的影响 采用western blot 方法检测MDRV 感染后的体外番鸭淋巴细胞α4 蛋白表达水平，结果显示，病毒感染组细胞中α4 蛋白含量在MDRV 感染3 h～12 h 持续上升，12 h 达到峰值；空白对照组细胞中α4 蛋白含量在3 h～24 h 持续上升，24 h达到峰值；经统计学分析显示，除48 h，各个时间点MDRV 感染组细胞α4 蛋白的表达水平显著或极显著(p＜0.05 或p＜0.01)高于空白对照组(图4)。结果表明MDRV 可以诱导感染的体外番鸭淋巴细胞表达α4 蛋白。

图3 兔抗rHis-α4 多克隆抗体琼脂双向扩散试验结果Fig.3 AGAR bidirectional diffusion test results of rabbit anti-rHis-α4 antibody

图4 MDRV 感染番鸭淋巴细胞后对α4 蛋白表达水平影响的检测结果Fig.4 Effect of MDRV on the expression level of integrin α4 protein in lymphocytes of Muscovy duck

2.5 CFSE 活细胞染色 10 μmol/L CFSE 标记终浓度条件下，选用PBS 为孵育液，对番鸭淋巴细胞进行CFSE 标记。CFSE 标记淋巴细胞后，普通荧光镜下可见直径9 μm～12 μm 的圆形淋巴细胞，在荧光显微镜下可见带有绿色荧光(图5B)。

图5 显微镜观察CFSE 标记番鸭淋巴细胞(×100)Fig.5 Microscopic observation of CFSE - labeled lymphocytes of Muscovy duckling (×100)

2.6 MDRV 感染对雏番鸭淋巴细胞归巢至盲肠肠道黏膜的影响 将CFSE 标记后的淋巴细胞(即CFSE+淋巴细胞)通过肱静脉注射入番鸭体内，在MDRV 感染第6 d，取空白组和MDRV 感染组番鸭的末端盲肠组织制备切片，观察CFSE+淋巴细胞在盲肠的分布情况及α4 在这些CFSE+淋巴细胞中的表达情况。IFA 结果显示，MDRV 感染组番鸭CFSE+(绿光)和α4+(红光)淋巴细胞均多于空白组番鸭，且α4 蛋白(红光)与CFSE 信号(绿光)在盲肠部位的淋巴细胞重合形成黄光(图6)，表明CFSE+淋巴细胞在表达了整合素α4 的同时向盲肠归巢，同时表明了在MDRV 感染雏番鸭后促进淋巴细胞归巢的过程与整合素α4 的表达有关。

图6 α4 蛋白番鸭盲肠组织淋巴细胞定位的免疫荧光检测Fig.6 Lymphocytes localization of cecum detected by immunofluorescence

3 讨 论

整合素α4 是淋巴细胞归巢相关的一个蛋白受体，能够与MAdCAM-1 配体结合而使得淋巴细胞达到归巢目的[10]。肠道自身的淋巴组织产生肠道淋巴细胞，这些新产生的淋巴细胞在离开肠道组织之后，进一步发育成熟，经淋巴循环回到肠道淋巴组织定居，发挥小肠黏膜免疫反应的作用[11]，而盲肠是番鸭体内淋巴细胞一个重要的归巢部位。为研究α4 蛋白与MDRV 感染诱导肠道淋巴细胞归巢的相互关系，本实验首次构建了pET-His-α4 重组表达质粒，并原核表达了重组番鸭整合素α4 蛋白，制备了抗rHis-α4 兔源多克隆抗体。利用该多克隆抗体进行相应的western blot 和IFA 检测。Western blot 结果显示，MDRV 感染诱导体外番鸭淋巴细胞中整合素α4 大量表达；IFA 组化实验检测结果显示MDRV感染的雏番鸭盲肠α4+(红光)和CFSE+(绿光)淋巴细胞呈增加趋势，且两种荧光信号重合形成黄光，这表明MDRV 感染促进了整合素α4 的表达的同时还导致了归巢至盲肠黏膜的淋巴细胞增加。以上结果表明雏番鸭感染MDRV 后诱导淋巴细胞归巢受体α4 表达，增强了淋巴细胞滚动和跨内皮迁移，以调控淋巴细胞归巢至肠黏膜。

有研究发现，细胞表面整合素分子通过与其配体作用将细胞稳定粘附于血管壁，而只有表达α4β7的细胞才有可能进入粘膜部位，参与一些炎症反应，并对肠相关淋巴组织的发育、粘膜部位的免疫应答等有重要作用[12]。也有研究表明整合素α4β1含量升高能够使淋巴细胞聚集在肠道，引起肠道炎症和加剧疾病严重程度[13]。淋巴细胞归巢是淋巴细胞迁移的一种特殊方式，对机体有利有弊。当MDRV 感染后，24 h～36 h 可引起机体肠道黏膜出现炎症反应，机体出现免疫应答。严重感染时，造成肠道黏膜结构的破坏、黏膜免疫相关细胞数量的减少，引起免疫屏障功能的严重损伤[14]。而本研究发现MDRV 感染后α4+淋巴细胞增加，效应T 细胞更多的向黏膜部位迁移。因此，MDRV 感染后雏番鸭肠道黏膜免疫系统被破坏可能与MDRV 感染导致α4+淋巴细胞增加促进的肠道淋巴细胞归巢有关。同时，也有研究发现，MDRV 感染促进肠道炎性介导活性因子IL-1β、IL-6、IL-8 和TNF-α 的表达，机体免疫平衡被破坏，加速肠道局部炎症反应，该过程与淋巴细胞归巢至肠道黏膜从而参与炎症反应，促进炎症因子的表达密切相关[15]。本研究发现，MDRV 感染诱导雏番鸭α4+淋巴细胞增加，促进了大量淋巴细胞归巢至肠黏膜，从而导致番鸭肠道出现炎症反应，肠道黏膜结构功能遭到破坏，机体免疫功能出现障碍。

本实验首次制备了番鸭整合素α4 亚基兔源多克隆抗体，该抗体可以用于番鸭整合素α4 亚基示踪的相关研究，为MDRV 感染诱导淋巴细胞归巢与其机制研究奠定基础。