刘琴 时建国

慢性乙型肝炎(chronic viral hepatitis B，CHB)是一种肝脏疾病，在临床上极为普遍，慢性乙肝病毒(HBV)感染是其主要致病因素，随着患者病情的发展，患者可出现各类的肝脏病变，其中肝脏纤维化在患者中比较常见[1]。及时了解患者是否存在肝纤维化及纤维化程度是治疗此类患者的关键[2]。以往相关报道表明[3]，内质网(endo-plasmic reticulum，ER)会产生应激，主要原因是机体内HBV一直进行复制及表达，并且ER应激会影响受HBV感染后机体肝脏内不可控制的炎症的变化和发展，但准确的调控机制仍需继续探讨。中脑星形胶质细胞源性神经营养因子(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor，MANF)蛋白是一种以高尔基体和内质网为主要编码区域的分泌性蛋白。目前研究[4-5]认为，ER应激可以提高MANF基因的表达水平和蛋白的分泌水平，MANF蛋白高表达可能有助于抑制肝脏受到损伤后的过度炎症及纤维化反应，但MANF蛋白表达水平是否与慢性HBV感染后肝脏纤维化的发生发展密切相关目前鲜有报道[6]。本研究通过检测我院接收的乙肝患者外周血MANF蛋白的表达情况，来探究MANF蛋白对乙肝患者肝脏纤维化程度的诊断效果。

资料与方法

一、一般资料

选取2016年9月至2017年9月96例我院接收的乙肝患者进行研究，其中女性42例，男性54例，年龄25～52岁，平均年龄(29.2±18.5)岁，将上述患者按照肝纤维化程度分为轻度肝纤维化组、中度肝纤维化组、重度肝纤维化组。同时选取50例在我院体检后显示健康者作为对照组，其中女性29例，男性21例，年龄22～52岁，平均年龄(26.6±15.4)岁。乙肝患者与对照组在性别和年龄比较不具有统计学意义，具有可比性(P>0.05)。

纳入标准：(1)所有患者均经病理确诊为乙肝病毒感染。(2)所有患者均自愿加入研究。

排除标准：(1)并发严重的心脏、肝脏及肾脏疾病；(2)由于其他原因引发的肝功能障碍患者；(3)并发类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等风湿性免疫系统疾病；(4)并发甲亢或糖尿病等患者。

二、方法

(一)ELISA法检测MANF蛋白水平 采集乙肝患者以及体检健康者空腹时的外周血5 mL，将血清分离出，于零下80℃的环境下保存备用。使用MANF检测试剂盒进行样本检测，步骤如下：①检测标本分别设置待测样本孔、标准孔和空白孔，将50 μL待测样本分别加入相应的检测孔中，在37℃下培育2 h，倒掉剩余液体并将标本甩干；②在每个检测孔中加入50 μL检测溶液A，在37 ℃下培育1 h；③倒掉检测孔中的液体，在每个检测孔中加入180 μL洗涤液，浸泡2 min，将酶标板内液体甩掉或吸去，重复洗涤3～4次；在检测孔中加入50 μL检测溶液B，在37℃环境下培育0.5 h；接着倒去检测孔内液体并甩干，将酶标板清洗4-5次；④在每个检测孔内加入45 μL底物溶液，在37 ℃下避光显色20分钟，在每个测试孔中加入25 μL终止液，将反应终止，蓝色立即转变为黄色；⑤用酶标仪在450 nm波长测量各检测孔的光密度值。

(二)病毒学指标和生化指标检测 采用实时荧光定量PCR检测HBV DNA，采用生化分析仪及相应试剂分别检测谷天门冬氨酸转氨酶、血清总胆红素、谷丙转氨酶，采用雅培化学发光法检测乙肝五项定量，采用血球分析仪检测血小板。

(三)肝脏活组织检查及诊断 采用1 s快速穿刺活检术在超声的引导下穿刺获取肝脏组织，长度2 cm左右，由HCHO固定，石蜡包埋，并连续切片，经染色后由光学显微镜观察，并分别由两名医师进行阅片诊断。

(四)评价方法 采用受试者工作特征(ROC)曲线及AUC评价指标进行评价分析，需计算FIB-4和APRI，FIB-4和APRI，以便较好地对乙肝患者肝纤维化程度进行评估。FIB-4指数基于谷丙转氨酶、天门冬氨酸转氨酶、血小板和患者年龄进行计算，FIB-4=(年龄×天门冬氨酸转氨酶)/(血小板×谷丙转氨酶的平方根)。APRI评分计算方法：APRI=[天门冬氨酸转氨酶/ULN×100)/血小板(109/L)]，其中ULN为天门冬氨酸转氨酶正常参考值上限[7]。

三、统计学方法

结 果

一、肝纤维化不同程度的乙肝患者外周血MANF蛋白的表达

对照组MANF蛋白的表达水平为(1.45±0.56)，轻度肝纤维化组MANF蛋白的表达水平为(1.75±0.84)，中度肝纤维化组MANF蛋白的表达水平为(1.85±1.02)，重度肝纤维化组MANF蛋白的表达水平为(2.21±1.12)，四组之间MANF蛋白的表达水平比较存在明显差异，具有统计学意义(P<0.05)，两组之间分别比较，与对照组相比，其他三组患者MANF蛋白的表达水平比较差异显著，均具有统计学意义(P<0.05)；与轻度肝纤维化组比较，重度肝纤维化组MANF蛋白的表达水平存在差异，具有统计学意义(P<0.05)；与中度肝纤维化组比较，重度肝纤维化组MANF蛋白的表达水平比较差异具有统计学意义(P<0.05)。但轻度肝纤维化组与中度肝纤维化组MANF蛋白的表达水平差异不具有统计学意义(P>0.05)。外周血MANF蛋白的表达水平与肝纤维化程度呈正相关(r=0.401,P<0.05)。

二、乙肝患者外周血MANF蛋白的表达水平与临床各个指标的相关性

根据谷丙转氨酶水平、乙肝病毒表面抗原水平、总胆红素水平、HBV DNA、乙肝E抗原状态及天门冬氨酸转氨酶水平，将96例患者进行分组，结果如下：乙肝病毒表面抗原<1 500 IU/mL时，MANF值为(2.15±0.61)，在1 500～20 000 IU/mL时，MANF值为(2.31±0.55)，>20 000时，MANF值为(2.23±0.53)；乙肝E抗原呈阴性时，MANF值为(2.24±0.56)，呈阳性时，MANF值为(2.21±0.55)；谷丙转氨酶<80 U/mL时，MANF值为(2.16±0.58)，在80～250 U/mL时，MANF值为(2.13±0.53)，在>250 U/mL时，MANF值为(2.23±0.65)；在HBV DNA<1 000 IU/mL时，MANF值为(2.16±0.51)，在1 000～100 000 IU/mL时，MANF值为(2.17±0.62)，在>100 000 IU/mL时，MANF值为(2.24±0.52)；天门冬氨酸转氨酶<80 U/mL时，MANF值为(2.12±0.55)，在80～250 U/mL时，MANF值为(2.46±0.59)，在>250 U/mL时，MANF值为(2.58±0.41)。结果提示在不同临床指标条件下分组进行比较时，不同天门冬氨酸转氨酶、谷丙转氨酶水平组间MANF蛋白的表达水平比较均具有明显差异，具有统计学意义(P<0.05)。

三、MANF蛋白对乙肝患者肝纤维化诊断效果的ROC研究

将96例乙肝患者以肝脏病理结果为金标准进行分组，重度肝纤维化40例，显著肝纤维化56例，分别进行ROC研究。MANF蛋白诊断显著肝纤维化的敏感度为0.647，,特异度为0.691，而诊断重度肝纤维化时的敏感度为0.931，特异度为0.467，与显著纤维化相比，诊断重度纤维化时敏感度增加，特异度降低。根据ROC研究整理图像信息，见表1。

讨 论

据以往相关报道说明，HBV的持续感染极易触发ER发生应激反应，但关于患者HBV慢性感染后肝纤维化的进一步发展以及肝脏情况中是否有MANF的参与方面的报道比较缺乏。有关研究人员猜测，MANF在患者由肝炎转变为肝硬化的过程中极有可能起着重要作用[8]。因此，本研究针对不同纤维化程度的乙肝患者外周血中MANF蛋白的表达水平进行了检测。

表1 MANF蛋白对乙肝患者肝纤维化诊断效果的ROC研究

研究结果显示，外周血MANF蛋白的表达水平与肝纤维化程度呈正相关；与体检健康者对照组相比较，轻度纤维化组、中度纤维化组与重度纤维化组MANF蛋白的表达水平差异具有统计学意义(P<0.05)；同时不同AST、ALT水平组间差异具有统计学意义(P<0.05)。根据本研究可知，MANF蛋白在肝纤维化阶段表达水平最高，ER应激可以上调MANF蛋白表达水平，推测ER应激作为一种因素参与了纤维化的进程。适度的ER应激是细胞的自我保护的一种方式，但过度的ER应激，则会导致细胞凋亡过度。推测在慢性HBV感染的早期阶段，即肝脏炎症和纤维化阶段，ER应激导致的MANF蛋白表达水平较高对肝纤维化发生发展起到一种保护作用，但当慢性HBV感染引起的持续的免疫损伤导致广泛假小叶形成时，肝细胞则呈现过度凋亡，ER应激不再是疾病发生发展的主要机制，因此，MANF蛋白表达水平下降[9]。我们根据ROC研究，探究MANF蛋白对乙肝患者肝脏纤维化程度的诊断效果，并将其与FIB-4和APRI指数进行比较，得出MANF蛋白诊断重度肝纤维化时的敏感度为0.931，特异度为0.467，而诊断显著肝纤维化的敏感度为0.647，特异度为0.691，与显著纤维化相比，诊断重度纤维化时敏感度增加，特异度降低，但可以与FIB-4和APRI指数形成互补，达到良好的诊断效果。

综上所述，MANF蛋白参与乙肝患者肝纤维化程度进展，可有效评估乙肝患者肝纤维化程度。