孟庆洋 徐春林 康鹏

越来越多的研究认为，肝硬化的发展与免疫机制有关，这种新型的程序性死亡被称为“ETosis”，以挤压的方式释放到细胞外，最终形成ET[1，2]。ET是细胞核内的DNA和胞质蛋白结合后释放在胞外形成的网状结构[3]。巨噬细胞释放的ET命名为巨噬细胞胞外诱捕网(macrophage extracellular traps，MET)[4]。本研究探讨氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)在肝硬化患者中是否通过巨噬细胞释放MET促肝硬化的发展。

资料与方法

一、研究对象

选择2018年1月至2018年10月哈尔滨医科大学附属第二医院感染科门诊诊治的肝硬化患者50例，男25例,女25例,年龄42～68岁,平均(49.3±7.1)岁;其中乙型肝炎肝硬化25例,酒精性肝硬化11例,丙型肝炎肝硬化7例,自身免疫性肝硬化4例,血吸虫性肝硬化2例,隐源性肝硬化1例。肝硬化诊断标准符合2010年中华医学会肝病学分会、中华医学会感染病学分会联合修订的《慢性乙型肝炎防治指南》。诊断主要依靠:①肝脏超声和 (或)肝脏弹性超声检查;②病毒性肝炎史及HBV、HCV血清学标志物;③自身免疫抗体;④饮酒史;⑤血吸虫病史;⑥其他器官疾病等。另选50名健康体检者作为对照，其中男25名,女25名,年龄30～66岁,平均(45.7±11.5)岁。

二、ET水平检测

分别采集肝硬化患者及健康人外周静脉血，检测MPO-DNA复合物水平，其间接反映ET的水平。ELISA试剂盒检测MPO-DNA复合物，按照说明书加入待测样本10 μL，稀释液40 μL，HRP标记的检测抗体100 μL，封孔，37℃温育60 min.弃去液体，洗板。每孔加入底物A、B各50 μL，37℃避光温育15 min，加入终止液50 μL，测定各孔吸光度值，按曲线方程计算浓度值。

三、ox-LDL水平检测

采集肝硬化患者及健康人外周静脉血，ELISA试剂盒检测ox-LDL，按照说明书在待测样品孔中先加入样品稀释液40 μL，再加入待测样品10 μL(样品最终稀释度为5倍)，将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

四、诱导巨噬细胞表型转换

1.巨噬细胞分离培养：采用Ficoll-Hypaque法分离提纯外周静脉血。按每孔2×105个细胞接种于96孔板中，向培养板中加入含156 ng/mL的PMA的培养液继续培养48 h。更换培养液，观察细胞贴壁情况，同时注意观察贴壁细胞的镜下形态。将所得巨噬细胞按照2×105个细胞/mL的密度接种于培养板上。

2.诱导、提取ET：将所得巨噬细胞用ox-LDL刺激5 h，随机取部分细胞行免疫荧光染色及扫描电镜检查，确认ET的形成。对剩余细胞进行反复震荡，取上清液，按照Picogreen dsDNA试剂盒(Invitrogen)说明书提取ET备用。

3.ET促进巨噬细胞发生表型转换：分别将获得的M1型巨噬细胞及M2型巨噬细胞分为M1/M2+PBS、M1/M2+ET、M1/M2+树突细胞和M1/M2+树突细胞+ET组。继续培养4 h，用流式细胞仪检测，记录各组中M1与M2的比例。比较分析培养过程中M1/M2的比例变化，分析IFN-α/IFN-γ水平与巨噬细胞M1/M2的比例的相关性，以及ET是否可以影响巨噬细胞表型转化。

结 果

一、ox-LDL、LPS、IL-6 刺激健康人巨噬细胞

以LPS、ox-LDL、IL-6分别刺激健康人巨噬细胞1、2、3、4、5和6 h固定染色，结果免疫荧光确定均无ET形成(图1)。

图1 LPS、ox-LDL、IL-6刺激健康人巨噬细胞镜下表现

二、PMA刺激肝硬化患者巨噬细胞

156 ng/mL、200 ng/mLPMA刺激肝硬化患者巨噬细胞1、2、3、4、5、6 h后固定染色，免疫荧光确定ET。结果200 ng/mL刺激1 h细胞核即破碎，出现凋亡坏死的迹象。156 ng/mL刺激4 h左右出现细胞核胀大，有的细胞膜甚至破裂，细胞内的颗粒流出(图2)。

注：箭头所示为细胞膜破裂颗粒流出

图2156 ng/mL PMA刺激肝硬化患者巨噬细胞4 h的镜下表现

三、巨噬细胞荧光染色结果

将培养的巨噬细胞在 156 ng/mL PMA浓度下分别进行2、3 、4、5 h的免疫荧光染色，发现4 h为最佳ET观察时期。3 h可见巨噬细胞有“吐核”的趋势，5 h大部分细胞已凋亡坏死仅剩部分细胞。3 h细胞膜破裂，可见胞内的颗粒流出，同时DAPI染色后可见云絮状的蓝色网状结构即为ET(图3)。

四、ox-LDL诱导巨噬细胞形成ET

免疫荧光染色3 h和4 h细胞的形态变化并不太明显，第5小时细胞核才出现明显的絮状物，而PMA加ox-LDL联合刺激巨噬细胞在第5小时已出现比较明显的蓝色絮状物，可见ox-LDL刺激巨噬细胞形成ET在第5小时最为明显，而PMA加ox-LDL可以促进这一进程，在同样的刺激时间蓝色絮状物出现的更多(图4)。

注：箭头所指蓝色网状结构为ET

图3156 ng/mL PMA刺激肝硬化患者巨噬细胞不同时间的镜下表现

五、ET诱导巨噬细胞M1型和M2型的转换

采用上述方法从外周血或人单核细胞系经PMA诱导形成巨噬细胞，取部分巨噬细胞即为M0分为两组，分别铺于6孔细胞培养板中，以IFN-γ(100 U/mL)和LPS (5 ng/mL)共同刺激培养24～96 h，诱导出M1型巨噬细胞；以IL-4 (10 ng/mL)刺激培养24～96 h诱导出M2型巨噬细胞，经ET诱导后进行流式细胞仪检测(图5)。

讨 论

最初有关ETosis的研究集中在杀菌和抗病毒方面，后续发现其在肝脏肿瘤免疫疾病方面具有重要作用[5-9]。ox-LDL是脂质发生氧化反应的产物，氧化应激反应激活、氧自由基大量生成是造成肝硬化肝脏损伤加重的重要病理环节[10-12]。因此 ox-LDL在肝硬化发展过程中起着一定作用。研究证实，ET可能与肝硬化程度相关[13]。

图5 流式细胞仪检测M1型、M2型巨噬细胞

本研究发现，ox-LDL 通过刺激巨噬细胞产生ET，且ox-LDL水平与ET水平呈正相关，增加ox-LDL刺激时间ET的产生亦明显增加，其发生机制可能与巨噬细胞的表型转换有关，而巨噬细胞表型与肝硬化发展之间的关系有待于进一步深入研究。

本研究表明，ox-LDL促进肝硬化的发展可能与巨噬细胞产生ET有关。期待将ET作为标志物，为肝硬化严重程度的诊断、治疗提供新思路。