徐子涵，蔡佳宇，李婧，商玮，赵智明，蔡辉

骨破坏是类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）主要的病理特征之一，往往导致进行性关节损伤和关节功能减退［1］。破骨细胞（osteoclast，OC）的活化是导致RA早期骨丢失的主要机制［2］，RA病人全身骨丢失的加重与OC活性增加密不可分［3］。核因子κB受体活化因子（receptor activator for nuclear factor-κB，RANK）是破骨细胞前体细胞（osteoclast precursor cell，OPC）或成熟OC表面的关键跨膜分子，被其配体（RANK ligand，RANKL）激活，导致OC分化过程中特异性基因的表达以及成熟OC骨吸收功能的活化［4-6］。姜黄素（Curcumin）是中药姜黄的主要药效成分，具有抗肿瘤、抗氧化、抗血管生成等多方面药理作用［7］。Chandran等［8］对活动性RA病人进行的临床研究已证实了姜黄素用药的安全性和有效性。本课题组前期在动物实验中发现，姜黄素提高佐剂性关节炎大鼠骨密度水平是通过调节RANKL/OPG（骨保护素）比值实现的［9］。本研究通过建立RA病人OC体外培养体系，探究姜黄素对RA病人OC分化中RANK基因和蛋白表达的影响及其可能机制，为姜黄素应用于RA骨破坏的防治提供依据。

图1 姜黄素对类风湿关节炎病人破骨细胞分化的影响（TRAP染色×200）：A为空白对照组；B、C、D分别为姜黄素2.5 μmol/L组、5 μmol/L组、10 μmol/L组

1 资料与方法

1.1一般资料病例为2015年1—12月在东部战区总医院门诊或住院治疗的RA病人12例，年龄（42.3±14.4）岁，符合2010年RA分类标准［10］，均处于疾病活动期。排除肝肾功能不全者，患有内分泌系统疾病及肿瘤性疾病者，长期服用抗凝剂、性激素类药物及调节骨代谢药物者。受试者均签署知情同意书，本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2材料胎牛血清购于杭州四季青生物工程材料有限公司，RANKL、巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony-stimulating factor，M-CSF）购于美国Pepro Tech公司，人淋巴细胞分离液购于美国Sigma公司，α-MEM培养基购于美国Gibco公司，抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP）染色试剂盒购于南京建成科技有限公司，实时荧光定量聚合酶链式反应（Real-time PCR）（Master Mix SYBR Green）试剂盒购于日本TOYOBO公司，RANK抗体购于Cell Signaling Technology公司。

1.3方法（1）建立外周血OC培养体系。采集RA病人外周血10 mL，密度梯度离心法分离外周血单个 核 细 胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC），接种于培养皿中（2×106/cm2），培养箱（37℃，5%二氧化碳）内孵育2～3 h获得贴壁细胞，接种于24孔板中（2×105/cm2），用α-MEM培养基配置细胞培养液（100 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF及20%胎牛血清），2～3 d换液1次［11］。

（2）姜黄素细胞毒性检测。于96孔板中加入5×105/mL的单核细胞悬液（每孔100 μL），放置于培养箱中24 h，向培养板中加入含药培养基（0、2.5、5、10 μmol/L），每组3个复孔，置于培养箱中孵育24 h、48 h和72 h后，加入CCK-8溶液10 μL，孵育4 h，设空白孔（只含有培养基和CCK-8溶液），对照孔（含有细胞、培养基和CCK-8溶液）。用酶标仪于450 nm波长处测吸光度OD值，进行细胞存活率计算。参照下列公式：细胞存活率（%）=［（含药组OD值-空白孔OD值）/（对照孔OD值-空白孔OD值）］×100%。

（3）分组与给药。设4组：空白对照组（含100 ng/mL RANKL、50 ng/mL M-CSF的α-MEM培养基）；姜黄素2.5 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组和姜黄素10 μmol/L组为在空白对照组的培养条件下再分别加入2.5、5和10 μmol/L姜黄素溶液。每组设3个复孔。

（4）TRAP染色并计数。2～3 d换液并于光镜下观察细胞形态，直至见多核巨细胞形成后进行TRAP染色。参照说明书配制底物反应液，置于37℃水浴箱中10 min；随后将细胞固定，加入底物反应液置于培养箱中1 h，随后用苏木精复染2～3 min。染色阳性的体征为细胞胞质呈深红色、胞核呈蓝紫色。将TRAP染色阳性的多核巨细胞（细胞核≥3个）认定为OC。采用双盲法计数阳性细胞，每孔随机取10个视野（×200）计数OC个数，重复计数3次，取均值。

（5）Real-time PCR检测各组细胞RANK基因的表达。细胞培养至14 d，用TRIZOL试剂提取细胞总RNA，将RNA逆转录为cDNA，对cDNA样本进行Real-time PCR分析，检测RANK基因mRNA的表达。反应体系10 μL，cDNA模板（稀释10倍）1 μL，正、反向引物各1 μL，0.1%DEPC水7 μL。Primer 5软件设计引物（见表1），所有引物由南京金斯瑞科技有限公司合成，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）作为内参基因，实验重复5次，目的基因的相对表达值用2-ΔΔCT公式［12］进行标准化。

表1 PCR引物序列

（6）蛋白质印迹法（Western Blot）检测各组细胞RANK蛋白的表达。用RIPA提取细胞总蛋白，并进行蛋白定量（BCA法），煮沸变性5 min，上样后经10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，转移至聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜），5%脱脂奶粉封闭2 h，加入RANK一抗4℃孵育过夜，加入二抗，室温孵育2 h，曝光显影，计算各条带的灰度值，以β-肌动蛋白（β-actin）为内参蛋白，结果以RANK与β-actin吸光度比值来表示。

1.4统计学方法采用SPSS 22.0软件进行统计分析。观测资料主要为计量资料，以±s表示，多组间比较采用单因素方差分析+多重比较LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1姜黄素对细胞存活率的影响CCK-8检测结果显示，培养24 h姜黄素2.5 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组和姜黄素10 μmol/L组细胞存活率（%）分别为（99.28±4.03）、（98.91±2.80）、（99.54±4.50），与空白对照组（100.00±5.31）相比差异无统计学意义（P＞0.05）；培养48 h姜黄素各浓度组细胞存活率（%）分别为（97.90±1.71）、（96.57±4.01）、（95.50±4.33），与空白对照组（100.00±8.85）相比差异无统计学意义（P＞0.05）；培养72 h姜黄素各浓度组细胞存活率（%）分别为（93.94±8.10）、（97.61±8.23）、（92.49±8.65），与空白对照组（100.00±2.28）相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2姜黄素对RA病人OC分化的影响于200×光镜下观察，空白对照组细胞形态均一、分布均匀、轮廓清晰，有3～5个以上细胞核，符合OC的基本特征，见图1A。经不同浓度姜黄素干预后，视野内多核细胞数量明显减少，形态欠规则，大部分为未分化成熟的细胞，见图1B、1C、1D。

姜黄素2.5 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组和姜黄素10 μmol/L组TRAP阳性细胞数（个/10个视野）分别为（103.00±4.36）、（91.00±7.81）和（67.33±4.16），与空白对照组（166.00±11.53）相比均明显减少（P＜0.05），说明姜黄素对RA病人OC分化具有抑制作用。见图2。

图2 姜黄素对类风湿关节炎病人破骨细胞分化的影响

2.3姜黄素对各组细胞RANK基因表达的影响采用Real-time PCR法对各组细胞中RANK mRNA水平进行检测。姜黄素2.5 μmol/L组、姜黄素5 μmol/L组和姜黄素10 μmol/L组细胞中RANK mRNA的相对表达量分别为（1.03±0.12）、（0.48±0.10）和（0.26±0.04），与空白对照组（1.44±0.16）相比均明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05），说明姜黄素能抑制RA病人OC中RANK mRNA的表达水平。见图3。

图3 姜黄素对各组细胞核因子κB受体活化因子（RANK）基因表达的影响

2.4姜黄素对各组细胞RANK蛋白表达的影响蛋白质印迹法结果显示，与空白对照组相比，姜黄素2.5 μmol/L 组、姜黄素 5 μmol/L组和姜黄素 10 μmol/L组细胞中RANK蛋白表达水平明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。可见姜黄素具有抑制RA病人OC中RANK蛋白表达水平的作用。见表2，图4。

表2 各组细胞RANK蛋白表达水平/±s

表2 各组细胞RANK蛋白表达水平/±s

注：与空白对照组比较，aP＜0.05

组别空白对照组姜黄素2.5 μmol/L组姜黄素5 μmol/L组姜黄素10 μmol/L组F值P值次数5 5 5 5 RANK/β-actin 0.68±0.11 0.46±0.09a 0.36±0.08a 0.25±0.07a 21.278 0.000

图4 姜黄素给药与否的各组细胞核因子κB受体活化因子（RANK）蛋白电泳图

3 讨论

姜黄素是从中药姜黄中获得的四萜类化合物。《本草纲目》记载姜黄“治风痹臂痛”，《医林纂要》记载姜黄“治四肢风寒湿痹”。RA是慢性炎症性疾病，可造成关节损伤和骨质破坏，属中医“痹证”范畴。历代诸多医家将姜黄用于风寒湿痹，其中的代表方剂是五痹汤，以姜黄为君药，与羌活、白术、防己、甘草同用，通痹止痛。现代药理研究显示，姜黄素具有抗炎、抗氧化和抗癌活性［7］。本课题组前期研究表明，姜黄素能调节RANKL/OPG比值，提高佐剂性关节炎大鼠骨密度水平［9］。本研究进一步探索姜黄素在治疗RA骨破坏中的作用及其可能机制。

OC是主要的骨吸收细胞，来源于骨髓造血干细胞分化而来的单核-巨噬细胞系统，进入外周血后循环在单核细胞层。在多种因素的作用下，这些细胞特定向骨吸收区移动，黏附于骨表面由OPC融合成OC发挥骨吸收功能。OC的异常增生与活化在RA骨破坏中发挥重要作用［2］。OC是终末分化细胞，不能传代且存活时间短，难以分离获得［13］。外周血单核细胞诱导培养法由Fujikawa等［14］首次提出并实验成功，是常用的OC培养方法之一，适用于人体OC研究，可获得大量OC。本研究采用密度梯度离心法分离获得RA病人PBMC，贴壁培养后获得单核细胞，经RANKL和M-CSF诱导分化为OC。CCK-8检测姜黄素的细胞毒性，发现姜黄素2.5、5和10 μmol/L的浓度对细胞存活率无明显影响，故设定为本实验姜黄素干预浓度。TRAP是OC分化和骨吸收功能的特异性酶，是OC分化的标志物，与骨吸收功能密切相关。获得的细胞进行TRAP染色，通过TRAP染色阳性细胞计数来评估OC分化情况。结果显示，经2.5、5和10 μmol/L 姜黄素干预后，OC的数量较对照组明显减少，提示姜黄素能有效地抑制RA病人OC分化。

在OPC向OC分化的过程中，RANKL-RANKOPG系统发挥关键作用［15-16］。RANK是位于OPC及OC表面的I型跨膜受体蛋白，是RANKL信号的唯一靶向受体，在细胞表面与RANKL结合调节OC的分化与功能，促使OC相关基因如TRAP、组织蛋白酶K、基质金属蛋白酶-9等的表达［17-18］。本研究分别从基因和蛋白层面表明姜黄素抑制RA病人OC分化过程中关键信号分子RANK mRNA和蛋白的表达，说明姜黄素可能是通过降低OPC表面RANK的表达，使其与RANKL结合减少，从而减弱RANKL信号传导及下游转录因子的活化，抑制OC的分化成熟及功能。

综上所述，姜黄素对RA病人OC分化和成熟具有抑制作用，其机制可能与下调RANK基因和相关蛋白的表达有关。本研究初步探索了姜黄素抑制RA病人OC分化的可能机制，为开发姜黄素相关药物应用于RA骨破坏的治疗提供了实验依据。（本文图1见插图10-1）