BBO超低温探头在分析测试中的应用

2019-10-08高培峰

实验技术与管理 2019年8期

艾惠，高培峰

（北京理工大学分析测试中心，北京 102488）

核磁共振波谱仪（nuclear magnetic resonance，NMR）作为物质结构鉴定的重要大型仪器之一，具有快速、准确、无损、分辨率高等优点，可以提供分子的化学结构和分子动力学信息，已被广泛应用于分子结构解析以及物质理化性质表征[1]，是从事有机化学、药物化学、生物化学、石油化学、化学工业、材料化学、化学生物学、生命科学及食品科学等方面研究的重要工具[2-8]。

近年来，超低温探头得到了很大的发展，以其卓越的检测灵敏度而得到广泛应用[9]。本文结合我校分析测试中心Bruker Ascend 700 MHz核磁共振波谱仪、超低温探头的结构、技术指标及应用范围等方面，介绍了BBO超低温探头在分析检测中的应用。

1 超低温探头分类及原理

探头是连接样品和谱仪之间的纽带。根据杂核线圈和氢核线圈在探头内的位置不同，可以分为正相探头（杂核在内，碳谱灵敏度高）和反相探头（氢核在内，氢谱灵敏度高）（见图 1）。共振频率较低的原子核由于其γ值较小或天然丰度较低，共振信号较弱，因而接收线圈在里面可以提高灵敏度。

超低温探头由高温超导薄膜材料制成，当样品温度由温控单元维持时，使用闭环或开环制冷系统使超导线圈冷至25 K，消除谱图的电噪声，提高检测灵敏度。过去十几年内超低温探头的发展显著增加了核磁的灵敏度，使以前认为样品量太少无法检测的样品的测试成为可能。目前应用比较广的两种低温探头是基于闭环循环的氦冷却器低温探头（CryoProbe）和开环的液氮冷却系统低温探头（CryoProbe Prodigy）。低温探头工作原理，发射/接受线圈和调谐匹配电路维持在极低温度，以降低源自导体中的电子热运动所致的噪声（Johnson-Nyquist噪声）；在低温下，纯金属的电阻进一步下降，额外降低了噪声；前放、过滤器和发射-接收-转换也被冷却，以提升电子器件的噪声指数。探头和电子降低的噪声增强了信噪比，与常规室温探头相比，CryoProbe探头信噪比最多增加 5倍，CryoProbe Prodigy增加2～3倍。冷却系统控制了所有功能，一旦处于冷却状态，CryoProbe探头和常规探头一样使用，尽管离低温探头的冷却区域只有 1 mm远，样品能够在设定的温度下稳定。根据探头不同，温度可调范围在-40～135 ℃之间。

图1 反相探头与正相探头示意图

2 BBO超低温探头应用实例

BBO CryoProbe为正相探头，在最广泛的核范围内提供了最高的灵敏度，设计为同时观测和反相检测。除了1H和19F外，所有在31P和15N的NMR核都能够被观测/照射。所有这些核能够自动选择，利用ATM选项进行优化调谐和匹配，配有主动屏蔽的单轴Z轴梯度，用于直径为5 mm的样品。BBO H&F（BBO Cryo Probe）探头设计增强了19F和13C的灵敏度。19F可以在1H通道内调节到19F，不能进行观测1H对19F去耦（反之亦然）实验。除了表征的观测BB、对1H去耦的实验外，BBO H&F探头还能观测 BB、对19F去耦。

Bruker Ascend 700 MHz 核磁共振波谱仪的BBO H&F宽频超低温探头，用压缩低温氦气来冷却探头检测线圈到20 K附近和前放电子线圈到77 K附近，最大程度降低了可检测到的电子热噪声，探头检测灵敏度可提高3 ～ 4倍以上，检测时间减少16倍或者样品浓度减少4倍，对13C灵敏度最高，对31P到15N范围内的灵敏度提高了 4倍多，对1H的灵敏度提高了 3倍多，对19F的灵敏度提高了6倍多。其与700 MHz BBO常温宽频探头的技术指标见表1。对于不常用核、低丰度/低灵敏度核、天然产物化学或代谢组学等样品量小的检测提供了很好的解决办法。

表1 BBO H&F宽频超低温探头与常温宽频探头技术指标

图2是质量分数为0.1%乙基苯用700 MHz BBO H&F宽频超低温探头和400 MHz BBO常温宽频探头测试C13CPD谱图的比较（δ为化学位移）。其中，700 MHz扫描次数为16次，400 MHz扫描次数为1024次。从图2可以看出，用700 MHz BBO H&F宽频超低温探头测试灵敏度、天然丰度均很低且含量很低样品的碳谱扫描16次即可得到分辨率很高的碳谱谱图，而用400 MHz BBO常温宽频探头测试则须扫描1024次才能达到类似的分辨率。

图2700 MHz BBO H&F宽频超低温探头（NS = 16）与400 MHz BBO常温宽频探头（NS = 1024）C13CPD谱图

图3是仅用5.5 h采样得到的200 μg Taxal （paclitaxel，C47H51NO14，MW = 853.9）宽带去耦碳谱和DEPT-135谱。同时，2D HSQC谱也证明了在采样时间仅为1 h时，BBO H&F宽频超低温探头卓越的1H灵敏度，其测试结果均比 DHC超低温探头测试时间缩短了一倍多[9]。

图4是在700 MHz BBO 宽频超低温探头上用反转门控去耦方法测试3 h得到的氮谱谱图。图5是在700 MHz BBO 宽频超低温探头上测试15 min得到消除背景前后的一维11B谱图。图6是在700 MHz BBO宽频超低温探头上测试0.5 h得到的一维119Sn和51V谱图。图4—图6说明700 MHz BBO 宽频超低温探头对于低灵敏度、不常用核也具有非常杰出的灵敏度。以上实例证明700 MHz BBO宽频超低温探头对氢、碳及杂核均有卓越的灵敏度，是检测低丰度/低灵敏度核、不常用核及天然产物化学的优先选择。

图3 在700 MHz BBO H&F宽频超低温探头测试得到的200 μg Taxal碳谱

图4 在700 MHz BBO宽频超低温探头上用反转门控去耦方法测试3 h得到的15N谱图

3 维护及开放共享服务

图5 在700 MHz BBO宽频超低温探头测试15 min得到的11B谱图

图6 在700 MHz BBO宽频超低温探头上测试得到的一维杂核谱图

仪器维护保养是一项经常性的或定期的工作，也是一件技术性较强的工作[10]。超低温探头的维护保养需定期进行，每10000 h需对冷柜中的冷头和膜泵进行维护保养；每20000 h需对冷柜中的分子泵和室内机中氦过滤器进行维护保养；每月对室外机进行定期清理清洗，春天柳絮纷飞的季节需每周清理；定期查看监控笔记本电脑等，保证探头的正常运行。

目前整台仪器已实行开放共享服务，极大地提高了使用效率。两年多以来，超低温探头的高分辨率及高灵敏度的检测条件，为我校师生服务取得了一定的成果。我校王苏宁教授课题组结合超低温探头测试核磁氢谱、碳谱、硼谱及二维谱等表征手段在 Chem.Sci.[11-12]和 Macromolecules[13]等杂志发表文章；陈甫雪教授课题组结合超低温探头测试核磁氮谱在 Chem.Commun.[14]杂志发表文章；李晓芳教授课题组结合超低温探头测试核磁氢谱和碳谱在 Macromol. Rapid Commun.[15]和Org. Lett.[16]等杂志发表文章；胡长文教授课题组结合超低温探头测试核磁氢谱、碳谱和磷谱在Angew. J. Org. Chem.[17]等杂志发表文章。