刘振平，姜 容，夏明星

（1.重庆安全技术职业学院，重庆 404020；2.重庆海关技术中心，重庆 404020）

链霉素（streptomycin，STR）是从链霉菌中纯化而来的氨基糖苷类化合物，被广泛用于治疗人和动物由于革兰氏阴性细菌引起的感染[1-3]。食品中少量的STR残留会对人产生过敏反应、肾毒性和耳毒性[4-6]，因此，在环境分析和食品安全控制领域需要开发高灵敏的STR残留检测方法。

研究人员开发了多种用于STR检测的技术和方法，如高效液相色谱法[7-8]、液相色谱-质谱联用法[9-10]、放射免疫分析法、荧光免疫法和酶联免疫吸附法[11-12]等，然而这些方法需要繁琐的程序和复杂的预处理过程，因此不适合STR的快速和实时检测。高效液相色谱和液相色谱-质谱联用检测劳动强度大，且设备昂贵，在生物样品分析中，免疫分析方法如放射免疫分析法、荧光免疫法和酶联免疫吸附法可能与共存物质发生交叉反应从而产生干扰[13]。目前，利用核酸适配体特异性识别STR分子引起了广泛关注[14-16]，核酸适配体又称核酸适配子，是一段能以高亲和力与靶分子特异性结合的单链DNA或RNA分子[17-18]，由人工合成并通过体外指数富集配体系统进化技术筛选出来。与其他传感材料相比，适配体具有成本低、合成和改性简单、热稳定性好、毒性和免疫原性低、灵敏度高、反应快等优点，因此，适配体在生物传感器的研究与开发中具有较大潜力[19-20]。

氧化石墨烯（graphene oxide，GO）是石墨烯的衍生物，具有大量的表面氧基，如环氧、羟基和羧基，具有良好的亲水性和生物相容性[21-25]，同时，GO因具有大环芳香共轭体系而具有很强的光吸收能力且符合朗伯比尔定律，可用于定量分析[26]。适配体可通过非特异作用结合在GO表面[27]，增大GO在水中的溶解度。当目标物进入体系后，基于目标物与适配体之间的高亲和力，适配体会脱离GO，导致GO在水中的溶解度降低，吸光度也随之降低，从而实现对目标物的间接定量分析。本研究以体系GO的紫外吸收为信号，基于STR适配体与GO、STR和之间的相互作用建立了STR残留检测的适配体传感器。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

STR阴性蜂蜜 重庆蜂谷美地生态养蜂有限公司；洋槐花蜂蜜 市购；氧化石墨烯 南京先丰纳米材料科技有限公司；STR适配体（5’-TAG GGA ATT CGT CGA CGG ATC CGG GGT CTG GTG TTC TGC TTT GTT CTG TCG GGT CGT CTG CAG GTC GAC GCA TGC GCC G-3’） 生工生物工程（上海）股份有限公司；STR对照品 重庆葆光生物技术有限公司；磷酸盐缓冲溶液（phosphate buffer saline，PBS） 北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；其他试剂均为分析纯；实验操作过程中所用溶液均为超纯水（电阻率≥18.2 MΩ·cm）配制。

1.2 仪器与设备

TG16-W型台式高速离心机 湘仪离心机仪器有限公司；KQ-700DB型超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；TU-1901双光束紫外-可见分光光度计 北京普析通用仪器有限责任公司；Nova400场发射扫描电子显微镜 美国FEI公司；Vetex70傅里叶红外光谱仪德国Bruker公司；Zeta Sizer Nano ZS90粒径和Zeta电位分析仪 英国Malvern公司。

1.3 方法

1.3.1 实验原理

基于氧化石墨烯紫外吸收信号的核酸适配体传感器检测STR原理如图1所示。在GO饱和水溶液中，当无STR存在时，STR适配体碱基的环状结构与GO六元环结构通过疏水键和π-π键作用[28]，该作用对GO在水中的分散具有保护作用；当STR进入体系后，适配体与STR的特异性亲和力大于其与GO的非特异作用力，适配体与STR结合后脱离GO，导致GO分散性降低而聚集，离心后上清液紫外吸光度降低，进而建立STR质量浓度与GO吸光度之间的线性关系，实现对STR的高灵敏、特异性检测。

图1 基于氧化石墨烯紫外吸收信号的核酸适配体传感器检测STR原理示意图Fig. 1 Schematic diagram of streptomycin detection using aptasensor based on UV signal of GO

1.3.2 实验条件优化

1.3.2.1 GO质量浓度的选择

根据文献[29]报道，GO在水中的最大溶解度为0.712 mg/mL，为确保体系中GO处于过饱和状态，本研究选择1 mg/mL作为体系中GO的最终质量浓度。

1.3.2.2 适配体浓度优化

将300 μL不同浓度的STR适配体（50、100、200、500、800、1 000、1 200 nmol/L）与1.5 mL 2 mg/mL GO在室温孵育10 min。然后，用PBS将上述溶液稀释至3 mL，STR适配体的终浓度分别为5、10、20、50、80、100 nmol/L和120 nmol/L。室温孵育10 min后，10 000 r/min离心5 min，取上清液，稀释一定倍数后230 nm波长处测量吸光度。

1.3.3 STR的检测

在定量检测STR时，在优化的条件下，将一定浓度STR适配体300 μL与1.5 mL 2 mg/mL GO在室温下混合15 min。然后，加入不同质量浓度的STR标准溶液300 μL并稀释至3 mL，在37 ℃孵育90 min[30]，使适配体与STR充分结合。上述溶液中的STR终质量浓度分别为0.002 4、0.024、0.24、2.4、24 ng/mL和240 ng/mL。混合液在10 000 r/min离心5 min后，将上清液稀释后在230 nm波长处记录了紫外-可见吸收光谱。

1.3.4 特异性实验

按照1.3.3节方法分别测定终质量浓度为0.24 ng/mL的STR、氯霉素、四环素、卡那霉素、克林霉素、呋喃西林和呋喃唑酮溶液，重复3 次，结果与空白对比。

1.3.5 实际样品处理

以蜂蜜为检测对象测试基于氧化石墨烯紫外吸收信号的核酸适配体传感器对实际样品检测的实用性。具体步骤如下：分别取1 g蜂蜜，分别加水稀释至100 mL，加入STR标准样品，将混合样品混匀摇晃20 min后，在3 000 r/min离心20 min，取上清液备用。制成不同质量浓度的STR的蜂蜜实际样品，检测的具体步骤与标准样品相同，且STR的最终质量浓度分别为0.005、0.05、0.5、5 ng/mL和50 ng/mL。

1.4 数据分析

利用 Microsoft Office Excel 2010对实验所得数据进行基本处理，采用OriginPro 8.5作图和线性分析。

2 结果与分析

2.1 GO的表征

图2 GO扫描电镜图像Fig. 2 SEM image of GO

通过扫描电镜、紫外-可见吸收光谱和傅里叶红外光谱对GO进行表征。如图2所示，GO的扫描电镜图像为褶皱的片状结构，有明显分层，说明GO表面含有环氧基和羟基等增大了层间距。GO在230 nm波长处有明显的紫外吸收峰（图3）。如图4所示，3 000～3 700 cm-1为O—H价键伸缩振动峰，1 569 cm-1处为C＝C伸缩振动峰，1 401 cm-1处为—O—H变形振动峰，1 148 cm-1处为C—OH价键伸缩振动峰，1 003 cm-1处为C—O伸缩振动峰，表明GO表面含有较多的含氧基团。

图3 GO紫外吸收光谱图Fig. 3 UV absorption spectrum of GO

图4 GO傅里叶红外光谱图Fig. 4 Fourier transform infrared spectroscopy spectrum of GO

2.2 水动力直径和Zeta电位分析

利用动态光散射法监测GO与STR适配体相互作用前后的水动力直径和电荷变化[31]。如表1所示，在GO饱和溶液中加入终浓度80 nmol/L STR适配体15 min后，平均水动力直径由414.8 nm增大到455.3 nm，表明GO与适配体发生了相互作用[32]；加入STR并在37 ℃孵育90 min后，平均水动力直径明显降低，表明适配体与STR结合后从GO表面分离；在Zeta电位变化情况也可以看出带负电荷的适配体与GO结合后电位明显降低，当加入STR后电位升高，进一步证明了本研究的实验原理。

表1 GO适配体传感器的水动力直径及Zeta电位Table 1 Hydration diameter and zeta potential of the GO-based aptasensor

2.3 实验条件优化结果

本研究选择1 mg/mL作为体系中GO的最终质量浓度，经过测试，此质量浓度的GO水溶液处于过饱和状态。适配体可以促进GO在水中的分散性，且不会因离心而聚集[33]。如图5所示，随着STR适配体浓度的增加，GO吸光度不断增大，当STR适配体浓度达到80 nmol/L时，GO吸光度增强变缓，表明80 nmol/L的STR适配体可以有效防止GO在水中聚集。因此，本研究选定80 nmol/L作为STR适配体实验浓度。在测定样品吸光度时，为确保测量值在量程范围内，经过反复实验，将样品离心后的上清液稀释10 倍后，测定的吸光度在准确的量程范围内，确保结果准确。

图5 STR适配体浓度对GO吸光度的影响Fig. 5 Effect of STR aptamer concentration on absorbance of GO

2.4 STR的定量检测结果

在优化的试验条件下，本研究建立适配体传感器对STR质量浓度梯度为0.002 4、0.024、0.24、2.4、24 ng/mL和240 ng/mL的标准品进行测定。如图6所示，在230 nm波长处，GO溶液的吸光度随着STR质量浓度增大而降低。以STR质量浓度的对数为横坐标，GO吸光度为纵坐标作图，结果显示，两者在STR质量浓度为0.002 4～240 ng/mL范围内存在良好的线性关系，线性回归方程为：A=-0.105 73lgCSTR+0.471 5，R2=0.994，检出限为0.001 3 ng/mL。该适配体传感器，有较低的检测限和较宽的检测范围（表2）。此外，将制备好的适配体传感器置于4 ℃条件下避光保存，在最优实验条件下，每隔1 d对质量浓度为2.4 ng/mL的STR进行检测，用以检验该适配体传感器的稳定性。在2.4 ng/mL STR条件下，紫外吸收测定结果的日内精密度为1.89%，日间精密度为2.64%。上述结果表明，放置一段时间的适配体传感器检测效果与最初制备的适配体传感器检测效果差异不大，具有良好的稳定性（7 d）。

图6 GO吸光度随STR质量浓度变化的紫外光谱Fig. 6 UV spectra of GO with varying STR concentrations

表2 本实验适配体传感器与其他方法比较Table 2 Comparison of the GO-based aptasensor with other detection methods

2.5 特异性实验结果

为验证该适配体传感器的特异性，排除实际样品检测中可能遇到的其他族类或结构类似抗生素的干扰，分别加入0.24 ng/mL的STR、氯霉素、四环素、卡那霉素、克林霉素、呋喃西林和呋喃唑酮反应进行吸光度测定。如图7所示，与空白对照，当检测体系中存在0.24 ng/mL STR时，吸光度明显降低，但是当检测体系中的STR由其他抗生素替代时，吸光度无明显变化。由此表明，本实验构建的适配体传感器对STR具有较高的特异性。

图7 适配体传感器特异性分析Fig. 7 Specificity analysis of the aptasensor

2.6 蜂蜜样品检测结果

分别取适量两种不同来源蜂蜜样品，按照1.3.5节方法进行预处理后，进行加标回收实验，加标回收率分别为89.3%～108.1%和94.7%～110.0%，相对标准偏差均不高于4.87%（n=3）。结果表明，该适配体传感检测方法准确可靠，可用于实际蜂蜜样品中STR含量的测定（表3）。

表3 蜂蜜样品中STR的检测结果Table 3 Detection of STR in honey samples using the aptasensor

3 结 论

本研究以紫外吸收为信号，以STR适配体促进GO在水中的分散性且与STR特异性结合为基础，构建了STR基于GO紫外吸收信号的核酸适配体传感器。通过简单地将GO、适配体和靶分子混合在一起，就可以得到检测结果，而且具有较高灵敏性。在优化的实验条件下，GO紫外吸光度信号随着STR质量浓度的增大而降低，且与STR质量浓度在0.002 4～240 ng/mL范围内呈良好的线性关系，检出限为0.001 3 ng/mL；同时，对不同来源的蜂蜜实际样品做加标回收率实验，回收率分别为89.3%～108.1%和94.7%～110.0%。由此表明，本适配体传感器可用于实际样品中STR的高效、高灵敏检测。本研究建立的适配体传感器所需设备简单、成本低、效率高，为动物源性食品和环境分析中STR残留的快速和现场高灵敏检测提供了新的方案。