康文丽，陈 亮，贺 博，吴 灿，周尚庭*

（加加食品集团股份有限公司，湖南 长沙 410600）

酱油是起源于我国的传统调味品，如今其产销量和生产企业规模均居调味品行业首位[1]。在酱油生产过程中，需要对酱油进行加热灭菌处理，常用的方式有2 种，一种是采用巴氏杀菌，另一种是采用高温瞬时杀菌。酱油的香气是衡量质量的重要指标，而关于酱油灭菌前后香气变化的研究报道较少。Steinhaus等[2]研究了日本酱油在145 ℃加热20 min前后香气的变化，发现经过加热后会新生成糠硫醇、2-乙酰基-2-噻唑啉和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，同时2-甲基丁醛、3-甲基丁醛、3-甲基丁醇和葫芦巴内酯的含量降低，而苯乙醛含量增加；Kaneko等[3]研究了日本真空包装酱油在80 ℃加热30 min前后香气变化，研究结果表明多数关键香气成分含量经过加热以后都略有升高，而4-乙烯基愈创木酚和2,6-二甲氧基-4-乙烯基苯酚含量增加最为显著；Meng Qi等[4]研究了日本酱油中具有果香的5 种酯类关键香气成分在80 ℃加热30 min前后的变化情况，研究结果表明经过加热后5 种酯类关键香气物质含量均降低；以上研究均对酱油进行了较长时间的加热处理。

分析酱油中香气成分在杀菌前后的变化情况，首先需要对其中的挥发性成分进行提取，目前可用于提取酱油中的挥发性成分的方法主要有水蒸气蒸馏[5]、同时蒸馏萃取[6]、溶剂直接萃取[7]、吹扫捕集[8]、固相微萃取[9]、溶剂萃取结合溶剂辅助风味成分蒸发[10]。采用水蒸气蒸馏和同时蒸馏萃取法时需要对样品进行加热，加热过程中会生成新的成分；溶剂直接萃取所得提取物中常含有不挥发或难挥发性成分，直接分析会影响色谱柱的寿命；采用吹扫捕集进行提取时，影响吹扫效率的因素较多；固相微萃取只是选择性吸附，萃取纤维的种类直接影响提取效果；溶剂萃取结合溶剂辅助风味成分蒸发是目前国际上公认的提取挥发性成分比较好的方法，本实验将采用溶剂萃取结合溶剂辅助风味成分蒸发法提取高盐稀态酿造酱油经过高温瞬时杀菌前后的挥发性成分，利用分子感官科学的方法研究其中香气活性物质的变化情况，为改进酱油生产工艺提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

未灭菌的高盐稀态酿造酱油样品由加加食品集团股份有限公司生产，主要原料包括豆粕、小麦、盐。

己醛（纯度98%）、3-甲基-1-丁醇（纯度99%）、2,5-二甲基吡嗪（纯度99%）、乙酸（纯度99%）、3-甲硫基丙醛（纯度95%）、芳樟醇（纯度98%）、丁酸（纯度99%）、3-甲基丁酸（纯度99%）、3-甲硫基丙醇（纯度98%）、甲基环戊烯醇酮（纯度99%）、愈创木酚（纯度99%）、苯乙醇（纯度99%）、麦芽酚（纯度99%）、4-乙基愈创木酚（纯度99%）、丁香酚（纯度98%）、4-乙基苯酚（纯度98%）、2-辛醇（纯度99%）北京百灵威科技有限公司；4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)呋喃酮（纯度98%）、2,6-二甲氧基苯酚（纯度98%）、苯乙醛（纯度95%） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；2-乙基-3,5-二甲基吡嗪（纯度99%）、糠醇（纯度＞98%） 北京华威锐科化工有限公司；5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（纯度＞98%） 藤州瑞元香料有限公司；香兰素（纯度99%） 北大正元香料公司；C6～C30正构烷烃（色谱纯） 美国Supelco公司；二氯甲烷、氯化钠、无水硫酸钠、碳酸钠、盐酸（均为分析纯） 国药集团化学试剂有限公司；苯乙酸（纯度96%）由苯乙酰氯水解制得。

1.2 仪器与设备

7890B-5977A气相色谱-质谱（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）联用仪、7890B GC仪美国安捷伦公司；Sniffer3000嗅觉（olfactometry，O）检测器 德国Gerstel公司；蝶形玻璃仪器 莘县京兴玻璃器皿有限公司；TIC-6i型高真空泵组 英国Edwards公司；DKB-501A型超级恒温水槽 上海森信实验仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将未灭菌的高盐稀态酿造酱油在120 ℃加热灭菌15 s，得到灭菌后高盐稀态酿造酱油。

1.3.2 样品香气评价

参照GB/T 14454.2—2008《香料香气评定法》，用评香条蘸取未灭菌和灭菌的高盐稀态酿造酱油样品，对其香气进行评价[11]。

1.3.3 液液萃取结合溶剂辅助风味成分蒸发法提取酱油中的挥发性成分

取100 mL酱油样品和50 mL重蒸的二氯甲烷放入锥形瓶中，200 r/min室温摇床1 h，结束后将酱油和二氯甲烷混合液4 ℃、8 000 r/min离心5 min，将下层有机层和上层酱油层进行分离。在分离出的酱油中继续加入二氯甲烷，重复以上操作，共萃取3 次，合并有机相得到萃取液。用溶剂辅助风味成分蒸发法将萃取液中的挥发性成分与非挥发性成分进行分离；首先在蝶形玻璃仪器的一侧加料漏斗中加入萃取液，其下接收瓶放入40 ℃水浴中，另一侧加入液氮进行冷凝，其下接收瓶液氮冷却，当真空泵压力为2.5×10-5mbar时开始滴加萃取液，滴加完毕后继续抽真空1 h，在液氮冷却的接收瓶中得到挥发性组分。

为了便于分析，将得到的挥发性组分分为酸性组分和中碱性组分。取10.8 g无水碳酸钠放入200 mL去离子水中搅拌溶解，每次取100 mL碳酸钠溶液对由溶剂辅助风味成分蒸发得到的挥发性组分进行洗涤，分出有机相，然后再用饱和氯化钠溶液洗涤（50 mL×2）有机相，得到的有机相即为中碱性组分，加入无水硫酸钠置于-20 ℃冰箱中过夜；在水相中逐渐加入盐酸溶液（由30 mL去离子水和30 mL盐酸配制）调节溶液pH值至1～2，用二氯甲烷（50 mL×3）进行萃取，得到二氯甲烷萃取物，合并萃取物得到酸性组分，加入无水硫酸钠置于-20 ℃冰箱中过夜。随后，将酸性组分或中碱性组分用韦氏蒸馏柱进行蒸馏、氮吹浓缩至0.5 mL，采用GC-O和GC-MS联用仪对所得浓缩物进行分析。

1.3.4 GC-O分析条件

G C条件：D B-W A X极性毛细管色谱柱（30.0 m×250 μm，0.25 μm）；程序升温：色谱柱起始温度为40 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升至80 ℃，之后以4 ℃/min的速率升至100 ℃，最后以6 ℃/min的速率升至230 ℃，保持5 min；载气He，载气流量1.0 mL/min[12]；进样口温度250 ℃，传输线温度250 ℃，嗅闻口温度220 ℃，经色谱柱分离后的组分以1∶2分别进入氢离子火焰检测器和嗅觉检测器；进样量1 μL，采用不分流模式。

在实验过程中由3 名经过训练的嗅闻人员对样品进行嗅闻，对嗅闻到的香气区域、保留时间以及香气强度进行记录，每人每个样品重复2～3 次，2 人以上嗅闻到的香气给予记录。

1.3.5 GC-MS分析条件

GC条件：与GC-O分析中的GC条件相同。

MS条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；四极杆温度150 ℃；扫描模式为Scan；质量扫描范围33～350 u。

1.3.6 定性与定量

定性分析：通过与标准品的香气特征、质谱和保留指数进行比对的方法对挥发性组分进行定性。

定量分析：采用2-辛醇为内标，通过内标标准曲线的方法对香气活性成分进行定量，其中以香气活性物质的浓度与内标的浓度比为横坐标（x），以二者的面积比为纵坐标（y）。

1.3.7 香气活性值的计算

香气活性值（odor activity value，OAV）等于香气活性物质在酱油中的浓度与其自身在水中阈值的比值；OAV大于1的香气活性物质对酱油的香气轮廓贡献大，被认为是酱油的关键香气物质。

2 结果与分析

2.1 香气评价结果

经过香气评价发现灭菌前后的酱油样品的整体香气特征接近，灭菌前的酱油头香中的烟熏香气突出；但是灭菌后的酱油头香中豆的青香和甜香，以及体香和基香中的酱香与焦甜均较未灭菌样品的强，且香气强度大，留香时间较长。

2.2 香气活性物质的鉴定

经过GC-O分析，共嗅闻到24 种香气活性区域，利用香气特征、质谱和保留指数对嗅闻到的香气进行初步定性，然后经过与标准品的相关数据和香气特征进行比对定性，见表1。

表1 灭菌前后酱油中香气活性成分Table 1 Odor-active compounds identi fi ed in soy sauce before and after sterilization

从表1可以看出，乙酸、丁酸、3-甲基丁酸、麦芽酚、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、丁香酚、香兰素、苯乙酸只在酸性组分中被嗅闻到，而2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪只在碱性组分中被嗅闻到。在鉴定出的24 种香气活性物质中醇类5 种、酸类4 种、醛类4 种、酮类4 种、酚类5 种、吡嗪类2 种。

鉴定出的5 种醇类香气活性物质中包括3-甲基-1-丁醇、芳樟醇、糠醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇，其中3-甲基-1-丁醇、3-甲硫基丙醇和苯乙醇作为香气活性物质曾在中国酱油和日本酱油中被鉴定出[2,13-14]，它们可由酱油生产过程中所使用的酵母菌通过Ehrlich途径代谢产生，其前体物质是亮氨酸、蛋氨酸和苯丙氨酸[15]；糠醇可由发酵过程中产生的葡萄糖经过氧化、脱羧和脱水形成[16]；意大利青霉菌可将酪蛋白氨基酸和葡萄糖转变成芳樟醇[17]。鉴定出的4 种酸类香气活性物质中包括乙酸、丁酸、3-甲基丁酸和苯乙酸，作为香气活性物质它们都曾在酱油中被鉴定出[10,14]，其中乙酸和丁酸可以由酱油生产过程中所使用的乳酸菌代谢产生[18]，3-甲基丁酸被认为是酵母蛋白代谢的副产物[19]。鉴定出的4 种醛类香气活性物质分别为己醛、苯乙醛、3-甲硫基丙醛和香兰素，己醛可由生产酱油时所使用的大豆或豆饼中的不饱和脂肪酸降解产生[20]；苯乙醛和3-甲硫基丙醛可由苯丙氨酸和蛋氨酸通过酵母的Ehrlich代谢途径产生[15]，也可以通过Strecker降解产生[21]；香兰素可由阿魏酸降解产生[22]，因为生产酱油时会使用小麦或小麦麸皮，而其中均含有阿魏酸。鉴定出的4 种酮类香气活性物质分别为甲基环戊烯醇酮、麦芽酚、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮；其中4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮既可以由还原糖与氨基酸通过美拉德反应产生，也可由酵母代谢产生[2,10,23-24]；甲基环戊烯醇酮可由果糖降解产生[25]。鉴定出的5 种酚类香气活性物质分别为愈创木酚、4-乙基愈创木酚、丁香酚、2,6-二甲氧基苯酚和4-乙基苯酚；作为香气活性物质愈创木酚、4-乙基愈创木酚、2,6-二甲氧基苯酚和4-乙基苯酚都曾在日本酱油中鉴定出，被认为是酵母发酵产生或者是阿魏酸降解产生[10]。鉴定出的2 种吡嗪类香气活性物质分别为2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，主要通过美拉德反应生成[26]。

2.3 香气活性物质定量结果

由表2可知，香气活性物质的总质量浓度在灭菌后略有降低（由57 629.37 μg/L降为51 229.57 μg/L）；醇类物质整体质量浓度呈降低趋势（由7 622.66 μg/L降为4 921.17 μg/L），而糠醇质量浓度有所增加；在加热过程中醇类物质可以被氧化成醛（3-甲硫基丙醛和苯乙醛质量浓度有所增加）或与酸反应生成酯，使其质量浓度降低；糠醇可由葡萄糖经氧化、脱羧和脱水形成[16]，加热有利于其形成。酸类物质整体质量浓度也呈现降低趋势（由31 059.27 μg/L降为23 818.51 μg/L），在加热过程中酸类物质可与醇反应生成酯类物质（由于酯类物质一般阈值较高，在GC-O分析中没有被嗅闻到）使其质量浓度降低。醛类物质的质量浓度都呈现升高的趋势，因为其主要由自身的前体物质通过降解产生，温度升高有利于降解反应，使其质量浓度升高。酮类物质质量浓度整体呈现升高的趋势（由16 623.71 μg/L升为19 753.97 μg/L），但甲基环戊烯醇酮质量浓度有所降低；经过加热灭菌处理以后4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮和5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮的质量浓度升高，与Steinhaus等[2]研究结果一致；麦芽酚可由还原性二糖降解产生[27]，加热有利于其产生；甲基环戊烯醇酮（3-甲基-2-羟基-2-环戊烯-1-酮）的含量有所降低可能与其自身结构有关，它存在3 种互变异构体，温度升高加速了异构体之间的互变，使其含量降低。酚类物质整体含量略有降低（由593.58 μg/L降为448.03 μg/L），而其中4-乙基苯酚的质量浓度有所升高（由49.92 μg/L升为59.32 μg/L）；Kaneko等[3]在研究日本酱油在加热前后香气的变化时所得结果也表明不同酚类物质含量变化不同。在灭菌前后吡嗪类物质的质量浓度基本没有变化，这与其主要通过美拉德反应产生，灭菌加热时间较短有关。

表2 灭菌前后酱油中香气活性成分Table 2 Concentrations of aroma-active compounds identi fi ed in soy sauce before and after sterilization

2.4 鉴定出的香气活性物质的OAV

表3 灭菌前后酱油中香气活性成分OAVTable 3 OAVs of AACs identified in soy sauce before and after sterilization

如表3所示，在灭菌前后的样品中均有18 种香气活性物质OAV大于1，它们是酱油样品的关键香气成分，但是灭菌后样品的总OAV增加；鉴定出的24 种香气活性物质中有6 种（糠醇、乙酸、丁酸、苯乙酸、甲基环戊烯醇酮和2,5-二甲基吡嗪）在灭菌前后的样品中OAV均小于1，它们对样品的整体香气贡献较小；有5 种（2-乙基-3,5-二甲基吡嗪、3-甲基丁酸、3-甲基-1-丁醇、丁香酚、2,6-二甲氧基苯酚）物质OAV大于1，但灭菌前后无变化，对2 个样品香气差别基本没有影响；有5 种（包括愈创木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈创木酚和苯乙醇）物质在灭菌后的样品中的OAV降低，其中愈创木酚和4-乙基愈创木酚具有烟熏香，OAV降低是灭菌后样品烟熏香气减弱的原因；有8 种（3-甲硫基丙醛、麦芽酚、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、苯乙醛、己醛、4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮、4-乙基苯酚和香兰素）物质在灭菌后的样品中OAV升高。3-甲硫基丙醛具有煮土豆香、酱香，是酱油的酱香特征香气成分之一，OAV由2 869增加至3 797，使得灭菌后样品的酱香、煮土豆香气增强；麦芽酚、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮（俗称酱油酮）和4-羟基-2,5-二甲基-3(2H)-呋喃酮（俗称菠萝酮），具有焦糖香，是酱油焦糖香特征香气的主要成分，OAV增加，使灭菌后样品的焦糖香增强；己醛具有青香和油脂香，它的OAV由25增加至35，使得灭菌后样品的香气透发；香兰素具有香荚兰和奶甜香，它的OAV增加是灭菌后样品甜香增强的原因之一；OAV的结果与香气评价的结果一致。结合OAV和定量结果可知3-甲硫基丙醛、麦芽酚、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、愈创木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈创木酚、苯乙醛、己醛等在灭菌前后样品中的质量浓度差别是导致酱油灭菌前后香气差别的主要原因。

3 结 论

采用液液萃取结合溶剂辅助风味成分蒸发法提取酱油灭菌前后样品中的挥发性成分，提取物经过GC-O分析，共鉴定出24 种香气活性物质，其中醇类5 种、酸类4 种、醛类4 种、酮类4 种、酚类5 种、吡嗪类2 种。

通过对鉴定出的24 种香气活性物质进行定量分析和OAV计算，发现在灭菌前后的样品中均有18 种香气活性物质OAV大于1，是样品的关键香气物质；其中关键香气物质中的3-甲硫基丙醛、麦芽酚、5-乙基-4-羟基-2-甲基-3(2H)-呋喃酮、愈创木酚、3-甲硫基丙醇、芳樟醇、4-乙基愈创木酚、苯乙醛、己醛等在灭菌前后样品中的质量浓度差别是导致酱油灭菌前后香气差别的主要原因。