唐 琴，孙威江,,*，陈志丹*，沈诗钰，周 喆，陈佳佳，陈翠翠

（1.福建农林大学园艺学院，福建 福州 350002；2.福建省安溪县现代农业产业园协同创新中心，福建 泉州 362400；3.福建省茶产业工程技术研究中心，福建 福州 350002；4.福建农林大学安溪茶学院，福建 泉州 362400）

我国是茶树的原产地，栽培茶树已有3 000余年的历史，拥有极其丰富的茶树种质资源，其中野生茶树是一类较为宝贵的资源，经过长期的进化，野生茶树蕴含着抵抗各种逆境所需的基因。苦茶是我国特有的一类茶树资源，早期多以野生茶树形式存在并被发现和利用，多分布于粤、湘、赣毗邻区，尤其以南岭山脉两侧最多[1]。苦茶通常具有较为独特的品质风味和保健功效。近年来针对苦茶资源挖掘和产品开发的研究也日渐增多，研究较多的有江华苦茶[2-3]和以苦茶碱为优势嘌呤碱的苦茶（Camellia assamica var. kucha Chang et Wang）[4]，从理化分析到分子生物技术等均有涉及，阐述了苦茶的独特性及其相应的形成机理[5]。福建蕴含丰富的特异性苦茶茶树种质资源，尤溪苦茶便是其中一类优质资源，距今已有200多年栽培生产历史。尤溪苦茶生长地区年均气温为15.5～16 ℃，日均最高气温仅23.5 ℃，海拔600～1 000 m，相对湿度84%以上。尤溪苦茶群体资源生长于当地含岩石碎屑的肥沃土壤中，四周植被资源丰富。发芽期较晚，一般在4月中旬，树型以灌木为主，少数为小乔木，树姿较直立，叶片形态为披针或长椭圆大叶，叶剧尖，叶缘有锯齿，芽头大多为紫色[6]，耐寒力、抗冻性等抗逆能力强，滋味苦、略涩、回甘，是当地传统民间药茶，具有重要的研究与保护价值[7]。

茶叶中苦涩味物质主要有茶多酚、儿茶素、花青素、生物碱、茶皂素和氨基酸形成的复合物等[8]。儿茶素中以酯型儿茶素含量最为丰富，呈苦涩味，且苦味比涩味强，花青素是紫芽茶苦涩味的主要影响物质；茶叶中生物碱主要有咖啡碱、可可碱和茶碱，是茶叶中主要的苦味物质；茶皂素味苦而辛辣，除此之外少部分的黄酮类物质也具有明显的苦味，茶叶苦味是多种物质共同作用的结果[9-11]。由于苦茶的独特性及其药用价值而受到越来越多生产企业和研究单位的关注，本研究从尤溪苦茶群体资源中采集33 株茶树资源对其苦涩物质及功能成分分析研究，探明引起苦涩味的功能物质成分，为尤溪苦茶的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

采集福建省尤溪县33 株长势好，持嫩性强的尤溪苦茶单株茶树的一芽二叶鲜叶，编号分别为CMC01～CMC33，以福云六号、福鼎大白、黄旦和铁观音为对照，参照文献[12]的方法，采用烘干固样法制成样品，保存于冰箱待测。

咖啡碱、可可碱、茶叶碱、没食子酸（gallate，GA）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechingallicacid，EGCG）和儿茶素（catechin，C）标样（纯度≥98%）美国Sigma公司；表儿茶素（epicatechin，EC）、表儿茶素没食子酸（epicatechingallate，ECG）、没食子儿茶素（gallocatechin，GC）、儿茶素没食子酸（catechingallate，CG）、没食子儿茶素没食子酸（gallocatechingallate，GCG）标样（纯度≥98%） 成都德思特生物技术有限公司；甲醇（色谱级） 德国Merck公司；甲酸（色谱级，纯度≥98%） 美国Aladdin公司；水为超纯水，其他试剂为市售分析纯级。

1.2 仪器与设备

2695高效液相色谱仪、2998型二极管阵列检测器、X-select-T3色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）美国Waters公司；TU-1810PC紫外-可见分光光度计北京普析通用仪器有限责任公司；FA1004型电子天平、MA150C-000230V1快速水分测定仪 赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；STARTER 3100 pH计 奥豪斯仪器（上海）有限公司；UNIQUE-R20纯水系统 厦门锐思捷科学仪器有限公司；HWS26型电热恒温水浴锅上海一恒科技有限公司；SB-5200DT超声波清洗机 宁波新芝生物科技股份有限公司；PULVERISETTE23微型研磨 德国飞驰仪器公司。

1.3 方法

1.3.1 花青素、可溶性糖和黄酮成分测定

花青素含量的测定参照周琼琼[13]和Pang Yongzhen[14]等方法提取花青素测定液进行测定并计算；可溶性总糖测定参照蒽酮比色法。总黄酮含量测定参照AlCl3比色法。实验设3 次重复，取平均值。

1.3.2 儿茶素组分和咖啡碱测定

采用高效液相色谱法，参照彭静等[15]的方法；咖啡碱前处理参照GB/T 8312—2013《茶咖啡碱测定》，儿茶素前处理参照GB/T 8313—2008《茶叶中茶多酚和儿茶素含量的检测方法》，设置3 次重复，取平均值。

1.4 数据处理

酯型儿茶素总量=ECG+EGCG+GCG+CG；非酯型儿茶素（简单儿茶素）总量=C+EC+EGC+GC；儿茶素品质指数=（EGCG+ECG）×100/EGC[16]。数据分析采用Excel进行统计，采用SPSS 19.0软件对数据进行单因素方差分析，并用Origin 2017软件绘制热图。

2 结果与分析

2.1 尤溪苦茶资源主要苦涩味物质成分分析

通过对33 份尤溪苦茶资源的主要苦涩味物质进行基本的统计分析，3 个生物碱组分和9 个儿茶素组分标准品液相色谱图如图1所示，统计结果如表1所示。尤溪苦茶主要苦涩味物质含量均具有一定差异，20 个指标变异系数在9.74%～73.08%之间，以GCG差异最大，EGCG最小，除EGCG外其余变异系数均大于10%，其中，花青素、可可碱、茶碱、生物碱总量以及除EGCG外儿茶素各组分的变异系数均超过20%，由此可见，尤溪苦茶苦涩味物质成分的变化幅度和变异系数均较大，遗传多样性丰富[17]。

表1 尤溪苦茶资源主要苦涩味成分生化统计分析Table 1 Statistical results of biochemical components of tea germplasm resources for Youxi bitter tea

图1 标准品色谱图Fig. 1 HPLC choromatograms of various standards

2.2 尤溪苦茶资源花青素与黄酮类和可溶性糖物质成分含量分析

紫色茶树芽叶中含量较高的花青素是其制茶苦涩味较强的主要原因之一[18]。由表1可以看出，花青素的变化幅度为0.93～3.62 mg/g，平均值为1.86 mg/g，变异系数为29.03%，花青素含量最高的单株为CMC28（3.6 2 m g/g），花青素含量最低的为C M C 2 0（0.93 mg/g），参照周喆等[19]紫化茶树品种C18-1春季含量（2.19 mg/g），筛选出花青素特异单株8 株（CMC18、CMC21、CMC22、CMC23、CMC26、CMC28、CMC32和CMC33）。由图2可知，与4 个对照样相比，苦茶资源花青素含量均值高于其对照，并与黄旦差异显著。茶叶中含有丰富的黄酮类物质，呈柔和的涩味感觉，阈值低，对茶汤苦味起增强作用，通常的味感是“苦而不甘”[20]，由表1可知，黄酮类物质变化幅度为2.92～4.85 mg/g，平均值为3.72 mg/g，变异系数为13.17%，黄酮类物质含量最高的为CMC13（4.85 mg/g），最低的为CMC12（2.92 mg/g），与对照相比，尤溪苦茶黄酮类物质含量均值低于对照，差异不显著（除黄旦）。茶鲜叶中的糖类物质包括单糖、寡糖、多糖及其他糖类，可溶性糖是构成茶汤甜味的主要成分，与甜度呈中度正相关[21]。可溶性糖还能缓解茶多酚和咖啡碱等物质引起的苦涩味，增加茶汤滋味的厚味和协调性。由表1可知，尤溪苦茶可溶性糖的含量变化幅度为5.24%～9.54%，平均值为7.65%，变异系数为18.95%，含量均值低于对照，并与黄旦、铁观音差异显著（图2）。

图2 尤溪苦茶花青素、黄酮、可溶性糖含量分析Fig. 2 Analysis of the contents of anthocyanin, flavonoid and soluble sugar in Youxi bitter tea in comparison with four control teas

2.3 尤溪苦茶资源生物碱组分含量分析

在一般茶种植物中，咖啡碱含量通常占干质量的2%～4%，可可碱约0.05%，茶叶碱约0.002%[22]。咖啡碱是单一的苦味物质，且阈值低，其含量与茶汤苦味呈高度正相关，可可碱和茶叶碱也呈现苦味，但相比咖啡碱苦味较弱[23]。由表1可以看出，尤溪苦茶中生物碱总量总变幅为3.10%～6.95%，均值为4.64%；咖啡碱总变幅为2.81%～5.49%，均值为3.98%，变异系数为15.02%，其中咖啡碱含量最高的单株为CMC24（5.49%），属于咖啡碱含量具有特异单株[24]，含量最小的单株为CMC11（2.81%）；可可碱总变幅为0.22%～1.18%，变异系数为36.63%，均值为0.62%，其中可可碱含量最大单株为CMC24（1.18%），含量最小单株为CMC11（0.22%），茶碱总变幅为0.01%～0.08%，均值为0.05%。由表1和图3可以看出，尤溪苦茶生物碱分布模式与茶种植物基本一致，均值含量明显高于4 组对照，并与对照差异显著。

图3 尤溪苦茶生物碱组分含量分析Fig. 3 Analysis of alkaloids content in Youxi bitter tea in comparison with four control teas

2.4 尤溪苦茶资源儿茶素组分含量分析

儿茶素作为茶多酚的主体成分，与茶叶滋味品质密切相关，分为简单（非酯型）儿茶素和复杂（酯型）儿茶素，在儿茶素组分构成中以酯型儿茶素为主。在茶叶中，一般含量较高的是EGCG和ECG，约占儿茶素总量的75%。儿茶素同时具有苦味和涩味，苦味相对较强，且苦涩味随着儿茶素的浓度增强而呈线性增强，其中苦味的增强速度大于涩味[25]。其中，简单儿茶素稍有涩味，收敛性弱，回味爽口。酯型儿茶素是茶叶苦涩味的主体，尤其是EGCG，对茶叶的苦涩起决定性的作用。儿茶素品质指数越高，鲜叶的嫩度和茶叶品质相对越好，特级绿茶的儿茶素品质指数一般大于500[26]。由表1可以看出，尤溪苦茶在儿茶素组分含量配比上有差异，儿茶素组分含量中含量最高的是EGCG，含量最低的是CG，儿茶素组分含量大小的总体趋势为EGCG＞ECG＞EGC＞GC＞C＞EC＞GCG＞CG，儿茶素总量变幅为16.44%～27.59%，平均值为22.14%，酯型儿茶素的总变幅为13.76%～20.85%，平均值为18.01%，EGCG总变幅为11.83～17.52%，平均值为15.26%，其中EGCG含量最大的单株为CMC33（17.52%），EGCG含量最低的单株为CMC25（11.83%），根据林金科等[27]特异单株的筛选标准（≥13%），尤溪苦茶基本表现为EGCG特异，其中含量不小于15%的特异单株有21 份。所有尤溪苦茶儿茶素品质均大于500，说明尤溪苦茶适制绿茶，与当地尤溪苦茶普遍制成炒青绿茶的现状一致[6]。

表2 尤溪苦茶资源儿茶素组分含量Table 2 Catechin contents in Youxi bitter tea leaves

由表2可知，儿茶素品质结果显示尤溪苦茶儿茶素指标与4 种对照茶树各儿茶素指标均存在一定差异，尤溪苦茶中总儿茶素含量明显高于4 种对照茶树，但均以酯型儿茶素为主，EGCG含量最高，与王冬梅等[28]研究结果一致。其中，EGCG含量、儿茶素总量和酯型儿茶素含量均显著高于对照，这3 类物质均表现为苦涩味重，其中苦味大于涩味，进一步说明了尤溪苦茶苦味突出的原因。现有研究显示茶叶是EGCG的唯一来源，因此尤溪苦茶可作为茶树品种改良的亲本资源，也可作为直接提取EGCG的特异资源加以研究利用。

2.5 尤溪苦茶资源总体差异性成分分析

图4 尤溪苦茶资源与对照总体差异性成分热图分析Fig. 4 Heat map analysis of the differential components of Youxi bitter tealeaves and control teas

为直观地展示20 个苦涩味物质成分在尤溪苦茶单株及对照间的差异，对所测数据进行热图和聚类分析，颜色偏向蓝色说明含量越高。如图4所示，茶树品种第1聚类分为2 个大类，一类是对照样品（黄旦、铁观音、福云六号和福鼎大白），一类是尤溪苦茶单株，说明尤溪苦茶与对照存在明显的差异，主要体现尤溪苦茶花青素、咖啡碱、可可碱、茶叶碱、生物碱、GA、GC、EGCG、儿茶素总量和酯型儿茶素具有较高的含量，而可溶性总糖、EGC和EC含量则低于对照，进一步说明尤溪苦茶具有其独特性，并在花青素、生物碱、EGCG、酯型儿茶素等苦涩味物质有别于一般茶叶，是尤溪苦茶味苦味浓的内在因子。尤溪苦茶中，CMC24独聚一类，与其他尤溪苦茶分开，结合表1和图4可以看出其在生物碱含量存在较为明显的特异，具有后续尤溪苦茶特异性重要的研究价值。

3 结论与讨论

3.1 尤溪苦茶的遗传多样性

尤溪苦茶群体资源的不同单株的主要苦涩味物质含量均具有一定差异，20 个物质成分指标变异系数在9.74%～73.08%之间，以GCG最大，EGCG最小，说明尤溪苦茶苦涩味生化成分存在丰富的多样性和变异性。根据王新超等[29]对我国苦茶资源研究表明，儿茶素组分中EC和C含量以及两者之和占总儿茶素比例能够体现茶树品种的进化程度，尤溪苦茶中EC和C的遗传变异系数分别为41.05%和45.73%，变异类型丰富，表明参试材料既有进化比较原始的类型，也有进化较高的类型，说明尤溪苦茶具有较多样的遗传基础。

3.2 尤溪苦茶苦味形成的生化机理

紫芽绿茶的滋味较苦涩是由于其特征成分花青素与儿茶素含量较高，咖啡碱本身呈现苦味，紫色芽叶苦涩味成分阈值呈咖啡碱＜花青素＜儿茶素，苦涩味指数表现为儿茶素＞咖啡碱＞花青素[30]。Yin Junfeng等[31]研究结果表明EGCG和咖啡碱之间具有苦味协同作用，且咖啡碱对EGCG的涩味具有增强作用。本研究结果显示尤溪苦茶的花青素、咖啡碱、可可碱、茶碱、EGCG、儿茶素总量和酯型儿茶素含量的均值均高于对照组，解释了尤溪苦茶苦涩味突出的原因是高含量的花青素、咖啡碱和儿茶素（特别是酯型儿茶素）以及它们的相互协同作用。研究表明尤溪苦茶可溶性糖总量的均值低于对照组，推测低含量的可溶性糖可能对尤溪苦茶苦味的产生起到一定的作用。研究还表明尤溪苦茶中黄酮含量均值略低于对照，因此推测黄酮物质可能并不是导致尤溪苦茶苦味的主要原因。

3.3 尤溪苦茶特异性单株的挖掘筛选

综合比较尤溪苦茶的苦味物质成分，筛选出含量大于5%高咖啡碱特异性资源1 份，含量大于1%的高可可碱特异性资源1 份，含量大于15%的高EGCG资源21 份，花青素含量较高的资源8 份，可作为后续深入开展苦茶苦味形成分子调控机理以及特异性茶树种质资源选育和利用的重要材料。为今后的杂交育种、创新加工、功能性成分开发与次生代谢机理的相关研究提供良好的材料基础。

3.4 尤溪苦茶资源研究与开发利用展望

近年，在相关部门和企业的重视和指导下，尤溪苦茶的独特品质受到了越来越多的关注，苦茶茶树资源也得到了一定的保护，并初步开展了一些繁育、引种和茶叶试制试验，但是尤溪苦茶这一特异性茶树种质还未得到系统保护、科学鉴定和充分利用，其特异性状形成的机理以及利用其开发独特功能性的茶叶产品的相关研究还比较缺乏。本研究收集保存了一批尤溪苦茶茶树种质并进行繁育，通过对尤溪苦茶的苦涩味物质含量展开研究，阐释尤溪苦茶苦味形成的化学机理，科学论证尤溪苦茶资源的特异性和珍稀性。在本研究的基础上，今后应重点研究和探析尤溪苦茶苦涩味形成的分子机理及其调控机制，可充分结合目前快速发展的多组学分析技术，全面深入地解析尤溪苦茶资源苦涩味突出的特异机理，为开发功能性产品和创新利用尤溪苦茶资源提供科学支撑。