邓斌　王锡奕　许冬青　康书鹏　张广波　庄鑫泓　王晓跃　许镇文

【摘要】 目的：觀察阿仑膦酸钠（ALN）对IL-1β体外诱导培养的大鼠膝关节软骨细胞的影响，探讨ALN治疗膝关节炎的机制。方法：取4周龄SPF级SD大鼠15只关节软骨细胞原代培养并传至第3代，将第3代软骨细胞平均分为3组：空白对照组（SD CON）软骨细胞用常规DMEM完全培养液培养5 d;IL-1β诱导组（SD IL-1β）软骨细胞用10 ng/mL重组人IL-1β培养2 d后更换为常规DMEM完全培养液培养3 d;

IL-1β+ALN组（SD IL-1β+ALN）软骨细胞用10 ng/mL重组人IL-1β培养2 d后更换为浓度为

1×10-6mol/L的ALN培养3 d。培养后取细胞进行比较观察，检测各组中Collagen Ⅱ、Wnt3a、Wnt5a及Wnt16的变化。结果：Collagen Ⅱ、Wnt3a、Wnt5a和Wnt16在软骨细胞中均有表达，经ALN处理后软骨细胞中Ⅱ型胶原蛋白增加。Wnt3a在空白对照组和IL-1β诱导组表达比较，差异无统计学意义（P>0.05），在IL-1β+ALN组中表达量明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）;Wnt5a在IL-1β诱导组中的表达量明显高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;ALN处理后，表达量降低，但仍高于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;Wnt16在IL-1β诱导组中表达量明显低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）;ALN处理后表达量升高，但仍低于空白对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。结论：ALN可能通过Wnt信号通路提高Wnt3a、Wnt16的表达与降低Wnt5a的表达，间接影响RANKL/RANK/OPG信号系统，并影响下游MMP-13、β-catenin及Collagen Ⅱ蛋白的表达来共同调节破骨细胞和成骨细胞的动态平衡，从而保护软骨和软骨下骨。

【关键词】 阿仑膦酸钠; Wnt信号通路; Ⅱ型胶原蛋白; 骨关节炎; 大鼠

Research of Mechanism on Affect of Alendronate Sodium on Wnt Signaling Pathway and Collagen Ⅱ in Knee Osteoarthritis Rats/DENG Bin，WANG Xiyi，XU Dongqing，et al.//Medical Innovation of China，2019，16（21）：0-030

【Abstract】 Objective：To research the effect of Alendronate Sodium（ALN）on chondrocytes induced by IL-1β in vitro in knee osteoarthritis rats and to explore the mechanism of ALN in the treatment of knee osteoarthritis.Method：Fifteen articular chondrocytes of 4-week-old SPF-grade SD rats were cultured and passaged to the third passage.The third generation chondrocytes were divided into three groups：blank control group（SD CON），chondrocytes were cultured in DMEM complete medium for 5 d.IL-1β induction group（SD IL-1β），chondrocytes were cultured with 10 ng/mL recombinant human IL-1β for 2 d and replaced with normal DMEM complete culture medium for 3 d.IL-1β+ALN group（SD IL-1β+ALN），chondrocytes were cultured with 10 ng/mL recombinant human IL-1β for 2 d and replaced with ALN with a concentration of 1×10-6 mol/L for 3 d.The changes of Collagen Ⅱ，Wnt3a，Wnt5a and Wnt16 in each group were detected.Result：The expression of Collagen Ⅱ，Wnt3a，Wnt5a and Wnt16 were found in chondrocytes，the increasing expression of Collagen Ⅱ after ALN treatment.There was no significant difference in the expression of Wnt3a between the blank control group and IL-1β induction group（P>0.05）.The expression of Wnt3a in IL-1β+ALN group was significantly higher（P<0.05）.The expression of Wnt5a in IL-1βinduction group was significantly higher than that in blank control group（P<0.05），after ALN treatment it decreased，but it was still higher than that in the blank control group（P<0.05）.And the expression level of Wnt16 in IL-1βinduction group was significantly lower than that in the blank control group（P<0.05），after ALN treatment it increased，but it was still lower than that of the blank control group（P<0.05）.Conclusion：By Wnt signaling pathway Alendronate Sodium can increase the expression of Wnt3a，Wnt-16 and decrease that of Wnt5a and indirectly affect the RANKL/RANK/OPG signaling pathway and the downstream factor，for example MMP-13，β-catenin and Collagen Ⅱ proteins，co-regulate the dynamic balance of osteoclasts and osteoblasts，protect cartilage and subchondral bone.

【Key words】 Alendronate Sodium; Wnt signaling pathway; Collagen Ⅱ; Osteoarthritis; Rat

First-authors address：Traditional Chinese Medicine Hospital in Puning City，Puning 515300，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2019.21.007

骨关节炎（osteoarthritis，OA）是中老年人常见而多发的慢性关节疾病，女性发病率高于男性[1]，这可能与女性内分泌的变化特点和骨质疏松有关。目前我国膝关节骨关节炎（KOA）的发病率随年龄增长逐步上升，王斌等[2]对中国人KOA流行病学特征进行系统评价，结果发现中国KOA的患病率约为18%。近年来国内外已有不少学者基于临床水平研究了治疗OA的药物，但OA发病原因和机制目前尚未完全阐明。文献[3]报道用阿仑膦酸钠（ALN）治疗OA，可明显改善膝关节炎的病理病变，取得了较好的效果，引起了很多学者极大的兴趣。本研究通过对IL-1β体外诱导培养的大鼠膝关节软骨细胞进行ALN干预，通过免疫细胞化学和实时PCR检测软骨细胞中Ⅱ型胶原（Collagen Ⅱ）、Wnt3a、Wnt5a及Wnt16等表达情况，观察ALN对大鼠膝关节软骨细胞的影响，探讨ALN治疗膝关节炎的作用机制，为临床应用ALN治疗OA提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验动物 4周龄SPF级SD大鼠15只，雌雄不限，体重100～150 g，由北京维通利华实验动物有限公司提供。

1.2 主要实验仪器 实时荧光定量PCR仪（ABI，7500），超微量核酸分析仪（Nano-200），PCR仪（北京东林昌盛科技有限公司，DL9700），倒置显微镜（OLYMPUS，CKX41）。

1.3 主要实验试剂 ALN（北京万生药业公司）;Collagen Ⅱ、多克隆抗体，Trizol（Invitrogen），甲苯胺蓝染色液（G3663），Wnt3a（abcam），Wnt5a（abcam），Wnt16（Santa），重组人IL-1β（abcam），DAB显色试剂盒（AURAGENE）。

1.4 实验分组 将第3代软骨细胞分为3组，空白对照组（SD CON）：软骨细胞用常规DMEM完全培养液培养5 d;IL-1β诱导组（SD IL-1β）：软骨细胞以10 ng/mL、重组人IL-1β培养2 d后更换为常规DMEM完全培养液培养3 d;IL-1β+ALN组（SD IL-1β+ALN）：IL-1β诱导后加ALN培养软骨细胞以10 ng/mL重组人IL-1β培养2 d后更换为浓度为1×10-6 mol/L的ALN培养3 d。培养后取细胞进行以下观察。

1.5 实验方法

1.5.1 大鼠膝关节软骨细胞原代培养 取4周龄SD大鼠，颈椎脱臼法处死后立即采用75%乙醇浸泡，在无菌条件下用滅菌消毒后的镊子和剪刀分离大腿腿骨，尽可能去除筋膜、肌肉和结缔组织;从关节处分离出软骨组织，剪成小于1 mm3的组织块，用含有双抗的PBS冲洗2次，加入3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37 ℃的恒温摇床中，震荡消化

30 min;4 ℃静置5 min，弃上清，加入0.2%胶原酶Ⅱ，置于37 ℃的恒温摇床中，震荡消化30～60 min;加入培养基终止消化，反复吹打后通过200目滤网。收集滤液，1 200 r/min离心8 min，弃上清，用培养基重新悬浮细胞，置于37 ℃，5%CO2细胞培养箱中培养，每3天更换培养液至第5天更换培养液，软骨细胞原代培养中，约24 h出现贴壁生长，细胞三角形或多角形，生长缓慢，培养3～5 d进入快速增殖期。

1.5.2 甲苯胺蓝染色 取处于对数生长期的大鼠关节软骨细胞，消化后以2×104个细胞/孔接种于铺有爬片的24孔板中，每孔最终培养基量为500 ?L，

培养24 h后吸去孔内培养基，用PBS清洗干净。每孔加入500 ?L多聚甲醛，固定15 min。吸去孔内多聚甲醛，用PBS清洗2次。每孔加入0.1%甲苯胺蓝染色液500 ?L，染色30 min后镜检拍照。

1.5.3 免疫组化 固定好的细胞爬片空气干燥

5 min，PBS冲洗后，1%Triton X-100（DPBS配制）孵育10 min，PBS冲洗，滴加适当稀释的一抗，空白对照组滴加等量PBS，37 ℃温箱放置1.5 h，孵育二抗，将载玻片从冰箱中取出，冲洗后，滴加50～100 μL二抗，37 ℃温箱孵育30 min将片子从温箱中取出，冲洗后滴加预制好的显色剂DAB工作液50～100 μL，室温孵育1～5 min，镜下控制反应时间，将显色后的片子蒸馏水洗涤，浸泡于苏木素中复染1～3 min，蒸馏水冲洗，95%酒精脱水

3 min，2次，中性树胶封片、显微镜观察。

1.5.4 qPCR染料法检测 采用Trizol法提取各组软骨细胞总RNA，RNA定量后逆转录合成第1链cDNA，用实时荧光定量PCR仪进行PCR反应。引物序列，见表1。PCR反应体系：上下游引物（10 μmol/L）0.5 ?L，cDNA 1.5 μL，ddH2O

10 μL，SYBR Green I 2×5 μL。PCR反应条件：

95 ℃、3 min，95 ℃、15 s，60 ℃、20 s，72 ℃、30 s

40个循环检测样本Ct值。以GAPDH为对照内参基因，并行统计学分析。

1.6 统计学处理 采用SPSS 19.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用SNK检验。检验水准α=0.05，以P<0.05为差异有统计学意义。