李 雷，于 婧

(吉林大学第一医院 第一手术室,吉林 长春130021)

致病性大肠杆菌O157是重要的食源性致病微生物，O157:H7是肠出血性大肠杆菌常见的血清型,是以食物为主要传播途径的致病菌,牛、羊、猪和鸡等家畜家禽是其主要宿主[1，2]，该菌致病性强、致死率高，引起全世界广泛重视[3]。溶源性作为温和噬菌体与宿主共存的一种现象广泛存在于自然界中。目前，物理或化学的方法是诱导溶源状态的噬菌体进入裂解周期的重要手段。国内外学者曾利用丝裂霉素C(MMC)诱导溶源性嗜盐古生菌及溶源性单增李斯特菌产生噬菌体[4，5]，但对溶源性大肠杆菌 O157诱导的具体方法探讨较少，本研究利用丝裂霉素C作为溶源状态噬菌体的诱导剂,设定不同的浓度梯度和时间梯度，具体讨论从大肠杆菌 O157中诱导产生噬菌体的条件及方法,并对诱导后的噬菌体基因组进行初步鉴定，为今后从溶源性大肠杆菌O157中诱导噬菌体提供方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料13株大肠杆菌 O157(YJ01、YJ02、YJ03、YJ04、YJ05、YJ06、YJ07、YJ08、YJ09、YJ10、YJ11、YJ12、YJ13)分离自长春地区养牛场，并经VITEK-32全自动微生物分析鉴定系统分析鉴定。

1.2 溶源性噬菌体诱导[6]①从平板上挑取大肠杆菌O157单菌落,接种于LB液管中,37℃培养过夜。②将活化的菌种以5%的接种量接入LB培养基中,37℃培养至对数生长期。③添加丝裂霉素C,使其终浓度达到0.5 μg/ml,静置培养16 h,4 000×g离心30 min，上清用0.22 μm滤膜过滤，4℃保存备用。

1.3 噬菌体制备及电镜观察遵循噬菌体颗粒提取的经典方法，制备噬菌体颗粒，参照Lu Z等的文献[7]。在复膜铜网上滴15 μl左右噬菌体颗粒悬液，等待15 min，用1滴2%磷钨酸染色，待铜网干燥后，于电压80 kv的条件下，采用Hitachi透射电镜观察并拍照[8]。

1.4 噬菌体核酸的提取及酶切分析噬菌体全基因组的提取依照噬菌体基因组DNA提取的传统方法进行[9]。提取的噬菌体全基因组首先经琼脂糖凝胶电泳检测核酸提取质量及其纯度，然后分别用 DNA酶I、绿豆核酸酶、RNA酶A三种酶对噬菌体基因组进行消化，最终再次通过琼脂糖凝胶电泳实验对结果进行检测，从而初步鉴定噬菌体核酸类型。

2 结果

2.1 噬菌斑形态观察诱导结果用琼脂双层铺板检验，结果显示，未经过丝裂霉素C诱导的O157观察不到噬菌斑，整块平皿模糊、不透明，表明没有噬菌体释放。用丝裂霉素C 诱导后的细菌培养物的滤液，在滤液未作稀释时，可以看到大量的噬菌斑连成一片。滤液稀释10-1和10-2培养10-12 h，可以观察到单个噬菌斑，噬菌斑较小，且噬菌斑周围有不透明晕圈，噬菌斑直径在0.6-0.8 mm(图1)。

2.2 电镜观察将噬菌体粗制颗粒经负染，电镜观察并拍摄，电镜观察结果显示，该噬菌体头部直径约80 nm、尾长约180 nm(图2)，将其命名为DM001，从而证实噬菌体诱导成功。根据ICTV的最新分类标准，噬菌体DM001隶属于有尾噬菌体目肌尾病毒科[10，11]。

2.3 酶切分析提取的噬菌体基因组琼脂糖凝胶电泳显示只有一条清晰的条带(图3)，说明在此条件下仅诱导出1种噬菌体，且该噬菌体所提取的核酸没有宿主菌O157基因组的污染。RNAseA及绿豆核酸酶对该噬菌体基因组均不产生影响，电泳结果显示噬菌体基因组仍然完整并未降解，但核酸酶DNaseI组噬菌体基因组完全被降解，电泳结果并未出现条带，由此可以断定，DM001基因组为双链DNA。经BandScan软件分析，DM001大小约为30 Kb。

3 讨论

国内外大量的研究及生物信息学分析结果显示，在各类微生物基因组中都广泛存在着溶源噬菌体或其基因组片段。但由于敏感菌株筛选较难得到，这些溶源噬菌体的存在经常在研究中被人们忽视[12]。溶源状态是一种十分稳定的存在状态，在宿主菌中可持续存在多代。但在某些条件如紫外线、致癌剂、突变剂、X线等作用下，可打破其原有的溶源周期，使噬菌体进入溶菌性周期，这种现象称为前噬菌体的诱导与切离(excision)，发生率约为10-2-10-5[13]。但仍存在另一种奇特现象，有少数溶源性细菌中的前噬菌体，它们在利用细菌的系统合成自身的基因组后，并不立刻组装成成熟噬菌体对宿主菌进行攻击，这个现象即称为"治愈"。溶源性细菌是一种较顽强存在，相比于同种细菌，它对同种或有亲缘关系较近的噬菌体的抵抗力更强，从而使宿主菌获得某种噬菌体免疫性[14]。

图1 噬菌斑形态 图2 噬菌体DM001电镜图像图3 噬菌体基因组的核酸酶消化结果

本实验首先利用丝裂酶素C 进行溶源性噬菌体的诱导，从13株大肠杆菌O157菌株中诱导获得一株溶源性噬菌体，命名为DM001，诱导比例为7.69%，显示出较高的诱导率。然后透射电镜观察证实噬菌体诱导成功，证实获得1株溶源性噬菌体。结果表明，用丝裂霉素诱导溶源性噬菌体进入裂解周期是可行的，并且成功率较高。经分析得出，在丝裂霉素C的终浓度为1 μg/ml，经15 h诱导，进入裂解周期的噬菌体最多，噬菌斑数量肉眼可见量最大，故为诱导的最佳条件。最后利用绿豆核酸酶、RNAseA和 DNaseI分别对噬菌体基因组进行消化，琼脂糖凝胶电泳确定其核酸类型为双链DNA，经BandScan软件分析，得出初步结果，噬菌体DM001基因组大小约为30 Kb，确定噬菌体为一株双链DNA的细菌病毒，提取DNA后已进行测序，以便下一步在基因水平上进行深入讨论。