张 铁，杨本恒，杨永超

（1.文山学院环境与资源学院，云南文山663099；2.文山州生物资源开发研究中心，云南文山663099；3.文山州农业科学院，云南文山663099）

三七[Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen]为五加科人参属植物，有“人参之王”、“南国神草”等美誉，栽培历史悠久，为中国传统名贵中药材，主产于云南文山州和广西等地[1]。三七以根茎、肉质根和花入药，具有清热、止血、散淤、消炎、止痛、滋补等功效[2]。三七愈伤组织的获得可以进行三七组织培养、细胞培养、原生质体培养、种苗繁育等，对三七种质资源的保护与利用、优质种苗提供、次生代谢物质获取等方面具有重要意义。前人对三七愈伤组织诱导研究报道表明，2，4-D对三七愈伤组织诱导具有重要作用，但用量不一，而且不同外植体诱导愈伤组织的效率也不一样[3]，为找出适合三七外植体材料和探明2，4-D最佳浓度，本研究以MS为基本培养基，辅以0.5 mg/L的6-BA，研究了不同浓度2，4-D对三七不同外植体愈伤组织诱导的影响，以期为三七工厂化育苗、药理研究等打下基础。

1 材料与方法

1.1 供试材料

三七无菌组培苗由文山学院生物资源开发研究中心实验室提供。

1.2 试验方法

选用大小一致的三七组培苗，在无菌条件下分别从无菌组培苗的叶、叶柄、带部分叶的叶柄、主根和毛根上切取大小为0.5 cm的组织，并接种于5种培养基中，培养基激素种类及浓度见表1，每瓶接种4块。每处理接种10瓶，重复3次。基础培养基MS，蔗糖浓度3%，琼脂浓度0.6%，pH值5.8，并在24～26℃进行暗培养，对照为郑光植等[4]诱导三七愈伤组织的培养基。

表1 三七不同外植体愈伤组织诱导培养基

1.3 愈伤组织发生率及生长状况评价

接种40 d后观察愈伤组织发生率及生长情况。在统计诱导率时，只要有愈伤组织出现（包括污染者）即可计数。观察记载不同外植体在不同培养基中的愈伤组织发生位置、质地（致密、疏松）、颜色。

1.4 增殖率统计

增殖率统计方法参见许鸿源等[5]的方法，即培养40 d后，每重复随机抽5瓶，重复3次。取出愈伤组织称量鲜重，鲜重为5个培养瓶中三七愈伤组织鲜重（g）的平均值。

计算平均值以比较不同细胞分裂素对愈伤组织增殖量的影响，并使用SPSS 17.0进行统计分析。增殖率计算方式如下：

式中 ΔW：愈伤组织生长量（g）；W1：愈伤组织接种量（g）；W2：愈伤组织收获量（g）；P：愈伤组织增殖速率（%）。

2 结果与分析

2.1 三七不同外植体愈伤组织诱导率

三七的叶、带部分叶的叶柄、叶柄、芽、主根、毛根均可以诱导出愈伤组织，而且在5种培养基上经过40 d的培养，愈伤组织诱导率均达到了100%。

2.2 三七不同外植体愈伤组织发生情况

三七不同外植体接种5种培养基后，15 d左右出现明显的愈伤组织，40 d后不同外植体愈伤组织发生位置、颜色、质地等见表2。

表2 三七不同外植体愈伤组织的情况

2.3 不同浓度2，4-D对三七不同外植体增殖的影响

三七的叶、带部分叶的叶柄、叶柄、芽、主根、毛根均可在5种培养基上被诱导出愈伤组织，不同培养基对不同三七外植体愈伤组织促进作用不尽相同。以叶柄和芽为外植体时，愈伤组织的增殖效率较高，增殖率分别最高达到82.82%和80.61%，相对应的培养基为4号培养基和5号培养基（CK）。以主根和毛根为外植体时，1号培养基对增殖具有较好的效果，增殖率分别达到了55.54%和60.00%。以叶和带部分叶的叶柄作为外植体时，2号和3号培养基表现较佳，增殖率分别为49.27%和47.43%。部分三七外植体愈伤组织生长情况见图1。

图1 三七外植体愈伤组织生长情况

表3 不同浓度2，4-D对三七不同外植体增殖的影响

3 讨论

三七的茎、块根、叶、叶柄、幼嫩花蕾、花药均可作为外植体进行愈伤组织的诱导[3]，本研究中采用带部分叶的叶柄、主根、不定根及芽也能诱导出愈伤组织，这说明三七组织培养所用的外植体取材较为广泛。以无菌苗为材料，可以提供较多的叶、叶柄，而主根、不定根及芽较少，相较于叶，以叶柄诱导的愈伤组织质量较好，增殖效率较高，故叶柄是较佳的外植体材料。

使用植物激素是植物组织培养过程中调节细胞生长发育的常用手段，三七愈伤组织诱导多采用2，4-D、6-BA、IAA、KT、ZT、灵发素等激素中的 2种或3种以不同浓度进行组合[5～8]。本研究中6-BA浓度为 0.5 mg/L和 2，4-D浓度为 0.5～2.0 mg/L，均能诱导三七不同外植体愈伤组织，其中，叶柄随2，4-D浓度增加，其增殖率随之增加。最佳培养基为MS+6-BA 0.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L，蔗糖浓度 3%，琼脂浓度0.6%。另外，郑光植等所用的激素组合2，4-D 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L在芽和不定根作为外植体时表现较好，在其他文献中也有报道[8]，是用于三七组织培养较为经典的激素组合。