陈小蓉 杨宁 张燕红 黄坚 杨晓农*

（1，西南民族大学生命科学与技术学院 610041； 2，四川省宣汉县农业局 636150； 3，铁骑力士集团 621006）

犬细小病毒病是由犬细小病毒（Canine parvovirus，CPV）引起的一种以出血性肠炎、非化脓性心肌炎和白细胞显著减少为主要特征的高度接触性、致死性、急性传染病[1,2]。不同年龄、性别、品种的犬均可感染该病，但以刚断奶至90日龄的犬最易感，病情也较严重。由于疫苗免疫或自然感染，成年犬是获得免疫的，而哺乳仔犬可通过乳汁获得母源抗体[3]，因此，哺乳仔犬和成年犬极少发病。

CPV 最先由美国的Eugster 于1977年通过电镜观察到[4]，随后被澳大利亚的Kelly 和加拿大的Thomson [5]同时从患肠炎的病犬分离获得。CPV 对外界环境有很强的抵抗力，加之易感动物又对其极敏感，因此，CPV 在出现后的很短时间内就在全球范围内广泛传播。由于不同国家或同一国家不同地区的免疫意识不同，因此，在不同国家或同一国家不同地区CPV 的流行情况有所区别。据报道，近年来，我国青岛地区[6]、田东县[7]、牡丹江地区[8]、河南地区 [9]的CPV 阳性检出率分别为11.03%、74.90%、50.00%、88.48%。而成都地区近几年没有CPV 流行情况的相关报道。本调查采用一步法实时荧光PCR 对采自成都地区6 家动物医院的145 份具有腹泻症状犬的粪便棉拭子样品进行CPV检测。了解成都地区CPV 的流行情况，为成都地区CPV 的防控提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要仪器设备

台式高速冷冻离心机（H2050R，长沙湘仪离心机仪器有限公司）； 荧光定量96 孔PCR 仪（FQD-96A，杭州博日科技有限公司）； 全自动高压灭菌锅（GR60DA，致微（厦门）仪器有限公司）； 洁净工作台（SW-CJ-2F，苏州安泰空气技术有限公司）； -80℃超低温冰箱（DW-86L828J，青岛海尔特种电器有限公司）。

1.2 主要试剂与耗材

POCKIT 细小病毒检测套组（包含：dNTPs，引物，探针，酶和CPV 阳性模板），购置于厦门金瑞（鸿捷）生物科技有限公司（批号：020717），该套组具有良好的灵敏度、特异性、重复性，可直接用于实时荧光PCR 检测； 天恩泽柱式病毒DNAout 试剂盒，购置于北京天恩泽基因科技有限公司（批号：217059hgz）。

1.3 粪便样品的采集与处理

2016年9月至2017年9月在成都市6 家动物医院采集具有腹泻症状的犬粪便棉拭子样品共145 份。在洁净工作台中，将加有双抗的DMEM 按4ml 每份分装于5ml 灭菌EP 管中，于4℃保存备用。采样时将无菌棉签轻轻旋转插入具有腹泻症状的犬肛门内，停留片刻后轻轻取出，放入装有DMEM 的EP 管中，并使棉签头完全浸入DMEM 中，于-20℃暂时保存； 样品至实验室后，于-80℃保存备用。

1.4 粪便样品病毒核酸的提取

按照天恩泽柱式病毒DNAout 试剂盒的说明书提取粪便样品病毒核酸，提取完后于-20℃保存备用。

1.5 粪便样品的CPV检测

按照POCKIT 细小病毒检测套组的说明书配置PCR 试剂，并建立以下25μlPCR 反应体系：2μlNDA 模板，23μl 回溶好的Premix。按照上述PCR 反应体系，利用荧光定量96 孔PCR 仪进行CPV检测。一步法实时荧光PCR 反应条件为：93℃20s，1个循环； 93℃15s，60℃1min，40 个循环。

1.6 统计分析

根据采样记录和检测结果，分别计算不同性别、不同年龄、不同品种、不同免疫状况犬的CPV检出率及不同季节CPV的检出率，然后使用SPSS （IBM SPSS Statistics 21.0），用χ2检验各检出率之间的差异性。＜0.01 为差异极显著；＜0.05 为差异显著；＞0.05 为差异不显著。若两个检出率间的差异极显著则其肩标为不同大写字母； 若两个检出率间的差异显著则其肩标为不同小写字母； 若两个检出率间差异不显著则其肩标为相同小写字母。

2 结果

2.1 粪便样品的CPV检测结果

145 份样品中有120 份出现CPV 特异性扩增曲线，CPV 的阳性检出率为82.76%，部分扩增曲线见附图。

附图 一步法实时荧光PCR 扩增曲线

2.2 不同性别犬的CPV检出率

不同性别犬的CPV检出率见表1。χ2检验显示，不同性别犬的CPV检出率间差异不显著（＞0.05），表明CPV 的检出率与犬的性别无关。

表1 不同性别犬CPV 的检出率

2.3 不同年龄犬的CPV检出率

不同年龄犬的CPV检出率见表2。χ2检验显示，不同年龄犬的CPV检出率间差异极显著（＜0.01），表明CPV 的检出率与犬的年龄有关。其中1～3月龄犬的CPV检出率最高，为93.15%，其与4～8月龄犬的CPV检出率差异极显著（＜0.01），与9～12月龄犬的CPV检出率差异显著（＜0.05），与1 岁以上犬的CPV检出率差异不显著（＞0.05）。4～8月龄犬的CPV检出率、9～12月龄犬的CPV检出率及1 岁以上犬的CPV检出率间差异不显著（＞0.05）。

表2 不同年龄犬CPV 的检出率

2.4 不同品种犬的CPV检出率

不同品种犬的CPV 的检出率见表3。χ2检验显示，不同品种犬的CPV检出率间差异极显著（＜0.01），表明CPV 的检出率与犬的品种有关。纯种犬的CPV检出率比杂种犬的CPV检出率高。纯种犬的CPV检出率为88.62%，杂种犬的CPV 的检出率为50.00%。

表3 不同品种犬CPV 的检出率

2.5 不同免疫情况犬的CPV检出率

不同免疫状态犬的CPV检出率见表4。χ2检验显示，不同免疫情况犬的CPV检出率间差异极显著（＜0.01），表明CPV的检出率与犬的免疫情况有关。未免疫犬的CPV检出率明显高于已免疫犬。未免疫犬的CPV检出率为97.06%，已免疫犬的CPV 的检出率为48.84%。

表4 不同免疫状态犬CPV 的检出率

2.6 不同季节CPV 的检出率

不同季节CPV 的检出率见表5。χ2检验显示，不同季节CPV 的检出率间差异显著（＜0.05），表明CPV 的检出率与季节有关。春季CPV 的检出率最高，为90.38%，其与夏季CPV的检出率差异显著（＜0.05），与秋季以及冬季CPV 的检出率差异不显著（＞0.05）。夏季CPV 的检出率与秋季CPV 的检出率差异不显著（＞0.05），与冬季CPV 的检出率差异显著（＜0.05）。秋季CPV 的检出率和冬季CPV 的检出率差异不显著（＞0.05）。

表5 不同季节CPV 的检出率

3 讨论

本研究对采自成都市的145 份粪便样品进行CPV检测，检出率为82.76%，该结果明显高于河南省部分地区[10]、泰州[11]、郑州 [12]等地的调查结果，这可能与所采用的检测方法及调查对象有关，本调查采用灵敏度高的实时荧光PCR 对具有腹泻症状的就诊犬进行检测，而其他地区采用灵敏度较低的CPV 胶体金快速诊断试纸条对所有就诊犬进行检测； 该结果略低于2011～2013年河南省 [9]的调查结果，这可能与不同地区人们的免疫接种意识有关。据调查发现，公母犬均可感染CPV 且公犬的检出率略高于母犬，但经统计学分析发现，犬的CPV检出率与犬的性别无关（＞0.05），这与酒泉地区的报道 [13]一致； 犬CPV 的检出率与犬年龄有关（＜0.01），其中1～3月龄犬的CPV检出率最高，其次为4～8月龄犬，1 岁以上犬的CPV检出率最低，这可能是由于仔犬在断乳前受到母源抗体的保护，而断奶后母源抗体水平逐渐下降，如果此时未对其进行免疫接种，其对外界的抵抗力变低易被CPV 感染，而成年犬一般为CPV 获得性免疫，不易被CPV 感染，在平时饲养管理中应听从兽医等专业人员的建议，认真做好免疫接种工作，增强犬只的免疫力； 纯种犬的CPV检出率较杂种犬高，这与昌吉[14]、苏州[15]的报道一致，这可能与杂种犬较强的适应力和抵抗力有关； 未免疫犬的CPV检出率高于已免疫犬，这提示免疫接种可有效地预防CPV，因此，畜主应按时对犬只进行免疫接种； 犬一年四季均可感染CPV，但春季的检出率最高，这与河南[10]、乌兰察布 [16]的调查结果相一致，究其原因可能是由于春季冷暖空气交汇，天气多变忽冷忽热，犬自身的抗病能力随之下降，加之病毒在春季容易生长繁殖，所以犬易被CPV 感染，因此，在春季应做好饲养管理工作，以提高犬只自身的抵抗力，尽量选择比较好的天气遛狗，从而减少被病原感染的机会。

综上所述，该研究了解了成都地区CPV 的流行情况，丰富了成都地区犬CPV 的流行病学资料，为该地区犬的CPV 诊断及防控提供基本数据。