刘奂弟，李 莎，代雪霞，李冬晨，何思贤，郭帅锋，王藏雪，牛玉娜

(1.新乡医学院医学检验学院，河南 新乡 453003；2.河南省免疫与靶向药物重点实验室，河南 新乡 453003；3.河南省分子诊断与医学检验技术协同创新中心，河南 新乡 453003)

血小板数量及形态是血常规检测的重要内容，不仅可以帮助医生诊断血小板相关性疾病，还可以评估患者的治疗效果[1]。血小板对温度和保存时间较为敏感[2]，不当的保存温度和时间会影响血小板的形态及功能。在临床工作中，为了避免血小板激活，不能及时检测的全血标本均为室温保存。然而，温度越高，细胞的代谢会越旺盛[3]，在营养得不到及时供给的情况下，细胞的结构和功能会发生改变。因此，室温保存全血有可能不利于血小板形态和功能的维持。本研究将全血分别于室温和4 ℃条件下保存，观察血小板形态和功能的变化，旨在为临床合理选择全血样本的保存温度提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料选择30例健康志愿者为研究对象，男10例，女20例，年龄18～22(20±2)岁，入选标准：(1)出生至现在均居住于河南省；(2)无菌血症；(3)无高脂血症；(4)无糖尿病；(5)无感染；(6)无呼吸系统疾病；(7)无免疫系统疾病；(8)无血液系统疾病。本研究经新乡医学院伦理委员会审核批准，受试对象均知情并签署知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate，FITC)标记的抗人CD61抗体(FITC anti-human CD61 抗体)购自美国Biolegend公司，藻红蛋白(phycoerythrin，PE)标记的抗人CD62P抗体(PE anti-human CD62P抗体)购自美国Invitrogen公司，Sysmex KX-21血细胞分析仪配套稀释液、溶血剂和清洗液购自日本sysmex 公司，钙荧光探针Fluo-3AM购自北京索莱宝科技有限公司，瑞氏-姬姆萨复合染色液购自珠海贝索生物技术有限公司，无钙镁酚红的磷酸盐缓冲液(Dulbecco′s phosphate buffered saline，DPBS)购自美国Hyclone公司,二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide,DMSO)购自德国Merck公司；含乙二胺四乙酸二钾 (ethylenediaminetetraacetic acid dipotassium，EDTA-K2)抗凝剂的一次性真空采血管购自上海康健医疗器械有限公司，Sysmex KX-21血细胞分析仪购自日本Sysmex 公司，全波长扫描式多功能读数仪购自美国Thermo Scientific公司，Guava easyCyte HT流式细胞仪购自美国Millipore公司，BX51/52显微镜购自日本Olypus公司。

1.3 血小板形态观察及血小板数量、体积检测采集志愿者清晨空腹肘静脉血 2 mL，置于含EDTA-K2抗凝剂的真空管中，立即8字颠倒混匀，充分抗凝，作为对照组微量吸管虹吸取血7～8 μL，将血液滴于载玻片一端，并制备头体尾分明的舌形血涂片，血涂片完全干燥后，使用瑞氏-姬姆萨复合染色液染色，BX51/52显微镜下观察血涂片的质量及染色情况，在血涂片的体尾交界处观察血小板的形态、结构；同时，将其余血液标本置于SYSMEX-21血细胞分析仪，全血模式下检测血小板数量、大血小板比例(platelet large cell ratio，P-LCR)、平均血小板体积(mean platelet volume，MPV)和血小板分布宽度(the platelet volume distribution width，PDW)；然后将血液标本分为2份，其中1份4 ℃保存(4 ℃组)，另1份室温保存(室温组)，分别于保存4、8、24 h后按上述方法制作血涂片，观察4 ℃组和室温组血液标本中血小板的形态、结构；并使用SYSMEX-21血细胞分析仪检测4 ℃组和室温组血液标本的血小板数量、P-LCR、MPV和PDW。

1.4 血小板活化表面标志物CD62P检测采集志愿者清晨空腹肘静脉血10 mL，置于含有EDTA-K2抗凝剂的真空管，8字颠倒混匀，分为对照组、4 ℃ 4 h组、4 ℃ 24 h组和室温 4 h组、室温24 h组，每组2 mL。将对照组血液标本即刻进行梯度离心，将室温 4 h组、室温24 h组和4 ℃ 4 h组、4 ℃ 24 h组血液标本分别于保存相应时间进行梯度离心，获得血小板[4]，DPBS洗涤3遍，40 g·L-1多聚甲醛室温固定30 min，DPBS洗涤3遍，100 μL DPBS重新悬浮血小板，分别加入FITC anti-human CD61 抗体和PE anti-human CD62P抗体，室温孵育30 min，DPBS洗涤3遍，300 μL DPBS重新悬浮血小板，100目细胞过滤器过滤，将细胞悬液接种到96孔板中，Guava easyCyte HT流式细胞仪检测，观察血小板的绝对计数和荧光强度(arbitary unit，AU)，计算血小板的平均荧光强度[12-18]。

1.5 血小板内Ca2+水平检测采集志愿者清晨空腹肘静脉血10 mL，置于含有EDTA-K2抗凝剂的真空管，8字颠倒混匀，分为对照组、4 ℃ 4 h组、4 ℃ 24 h 组和室温 4 h组、室温24 h组，每组 2 mL。将对照组血液标本即刻进行梯度离心，将室温 4 h组、室温24 h组组和4 ℃ 4 h组、4 ℃ 24 h血液标本分别于保存相应时间进行梯度离心，获得血小板[4]，并进行计数，将血小板浓度调整为10×109L-1。用含有5 μmol·L-1Fluo-3 AM的DMSO溶液和细胞一起在室温下孵育30 min进行荧光探针装载，DPBS洗涤3遍，100 μL DPBS重新悬浮血小板，将细胞悬液接种到96孔板中，在激发波长为488 nm的条件下使用全波长扫描式多功能读数仪检测样本的荧光强度[5]。

2 结果

2.1 各组血液标本血小板形态变化结果见图1。与对照组相比较，随着血液标本保存时间延长，4 ℃组血小板体积稍增大，24 h时大血小板比例明显增多(图1A、图1B、图1C、图1D)，室温组血小板体积明显增大，并出现空泡现象(图1E、图1F、图1G)。全血保存4 h时，室温组大血小板明显增多，血小板结构较疏松(图1B、图1E)；全血保存8 h时，室温组大血小板明显增多，血小板结构较疏松并出现空泡现象(图1C、图1F)；全血保存24 h时，室温组畸形血小板明显增多，血小板结构较疏松，空泡现象更加明显(图1D、图1G)。

A：对照组；B：4 ℃组保存4 h；C：4 ℃组保存8 h；D：4 ℃组保存24 h；E：室温组保存4 h；F：室温组保存8 h；G：室温组保存24 h。

2.2 各组血液标本血小板数量、P-LCR、MPV和PDW比较结果见表1。对照组及室温和4 ℃组保存4、8、24 h组各组之间的血小板数量两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较，室温组和4 ℃组血液标本保存4、8、24 h的P-LCR、MPV、PDW均显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。室温组血标本保存4、8、24 h的P-LCR、MPV和PDW两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。4 ℃ 组血标本保存8、24 h的P-LCR和MPV与4 h时比较显著增大，差异有统计学意义(P<0.05)；4 ℃ 组血液标本保存24 h的P-LCR和MPV与8 h时比较差异无统计学意义(P>0.05)。4 ℃组血标本保存4、8 h的PDW比较差异无统计学意义(P>0.05)，保存24 h的PDW与4、8 h时比较显著增大，差异有统计学意义(P<0.05)。4 ℃组保存4、8 h 的P-LCR、MPV和PDW与室温组比较显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)；4 ℃组与室温组保存24 h的P-LCR、MPV和PDW比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 各组血液标本血小板数量、P-LCR、MPV及PDW比较

注：与对照组比较aP<0.05；与室温组比较bP<0.05；与4 h比较cP<0.05；与8 h比较dP<0.05。

2.3 各组血液标本血小板表面活化标志物CD62P表达水平比较对照组、室温组保存4、24 h时及 4 ℃ 组保存4、24 h时血小板表面CD62P表达水平分别为(65.57±2.86)、(84.36±2.69)、(85.79±3.11)、(77.18±3.22)、(83.8±2.12)AU。与对照组比较，室温组保存4、24 h及4 ℃组保存4、24 h的血小板表面CD62P表达水平均显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。与室温组同时间点比较，4 ℃ 组保存4、24 h的血小板表面CD62P表达水平均显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。室温组保存24 h的血小板表面CD62P表达水平与4 h时比较差异无统计学意义(P>0.05)。4 ℃组保存24 h的血小板表面CD62P表达水平与4 h时比较显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

2.4 各组血小板内Ca2+水平比较对照组、室温组保存4、24 h时及4 ℃组保存4、24 h时血小板内Ca2+水平分别为(539.25±130.39)、(714.00±81.70)、(963.25±58.25)、(535.75±98.87)、(605.00±220.40)AU。与对照组比较，室温组保存4、24 h血小板内Ca2+水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。对照组及4 ℃组保存4、24 h的血小板内Ca2+水平两两比较均无显著差异(P>0.05)。与室温组同时间点比较，4 ℃组保存4、24 h的血小板内Ca2+水平显著降低，差异有统计学意义(P<0.05)。室温组保存24 h的血小板内Ca2+水平与4 h比较显著升高，差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

血小板是巨核细胞脱落的细胞质颗粒[6]，在机体凝血、肿瘤发生和免疫过程中发挥着重要作用[7-9]。准确检测血小板的数量、体积、形态和功能不仅可以帮助医生诊断和鉴别疾病，还可以促进科学研究的发展。目前临床上不能及时检测的血液标本均为室温保存，有可能不利于血小板形态和功能的维持。因此，有研究探讨4 ℃条件下保存血液对血小板形态和功能的影响，旨在为临床合理选择血液样本保存方法提供参考。

龚庆辉等[10]研究显示，室温保存血液2 h，血小板的P-LCR、MPV和PDW已经发生显著变化；而 4 ℃ 保存24 h，可以观察到血小板的P-LCR、MPV和PDW发生显著变化。在该研究中，4 ℃保存组的样本进行血常规检测前，需要提前取出并使其恢复至室温，这个过程可能导致4 ℃保存组的血小板受到影响，发生显著变化；并且4 ℃保存组与室温保存组标本检测时间点不一致，4 ℃保存组未对保存2～8 h的血液进行检测，导致无法确定4 ℃保存组标本P-LCR、MPV和PDW发生变化的时间点。李清泽等[11]研究发现，4 ℃保存血液3 h，血小板MPV即发生显著变化；室温保存血液4 h，血小板的MPV才发生显著变化；在该研究中，尽管4 ℃保存组与室温保存组检测时间点一致，但4 ℃条件下存放的标本在测定前也均恢复至室温。因此，4 ℃保存组的检测结果同样无法排除室温的影响。

在本研究中，为了排除室温对4 ℃保存组检测结果的影响，进行相关检测前对4 ℃组标本不进行室温复温处理；同时，为了明确血小板功能是否受全血保存温度影响，本研究根据相关文献[5，12-18]的检测方法对血小板活化和Ca2+释放功能进行了研究。本研究结果显示：(1)对照组、室温和4 ℃组保存4、8、24 h组各组之间的血小板数量两两比较差异均无统计学意义，提示不同温度和保存时间对血小板数量无显著影响；(2)随着保存时间的延长，4 ℃组和室温组血小板体积均增大，且室温组血小板体积增加更加明显，并出现空泡现象，血小板结构较疏松；随着保存时间的延长，与对照组比较，4 ℃组和室温组P-LCR、MPV和PDW均显著增大，血小板表面CD62P表达水平显著升高。与对照组比较，室温组4和24 h的血小板内Ca2+水平均显著升高，4 ℃组4和24 h的血小板内Ca2+水平无显著变化。同时，4 ℃组24 h时血小板表面CD62P表达水平与 4 h 时比较显著升高，室温组24 h时血小板内Ca2+水平与 4 h 时比较显著升高；提示在4 ℃和室温保存状态下，随着保存时间的延长，会对血小板形态和功能造成一定的影响；(3)室温组保存4、8、24 h的P-LCR、MPV和PDW两两比较差异均无统计学意义；4 ℃组保存4、8 h的P-LCR、MPV和PDW与室温组比较显著降低，4 ℃组与室温组保存24 h的P-LCR、MPV和PDW比较差异无统计学意义；而4 ℃组保存8、24 h的P-LCR、MPV与4 h时比较显著增大，保存24 h的PDW与4、8 h时比较显著增大；提示血小板对保存温度比较敏感，室温保存4 h以后即会对血小板P-LCR、MPV和PDW造成较大的影响，而在一定时间内，4 ℃保存对血小板的影响低于较室温保存。

综上所述，全血标本4 ℃保存并在4 h内完成检测，可以最大限度维持血小板原始状态，提高血小板检测相关指标的准确性。