赵雅洲

研究背景

鹿花盘是梅花鹿或马鹿锯茸后，在鹿角基部留下的茸角骨化后，在下一个生茸期开始时脱落的部分。鹿花盘是我国一种传统名贵的中药，具有抗炎作用，用于治疗乳腺炎、风湿关节炎等。在实际临床应用中常将鹿花盘熬制成鹿角胶。然而，由于鹿花盘异常坚硬，熬制鹿角胶费时费力，资料显示其提取率只有17%。本课题主要研究如何提高鹿花盘的提取率，以提高其利用率。

鹿花盘中主要的有效成分是蛋白质。食品加工技术中经过膨化可以使玉米蛋白质得到降解，使蛋白质熟化变性利于吸收。膨化过程中，蛋白质分子结构伸展、二硫键等次级键部分断裂，使其结构发生变化，由原来紧密有序的结构变成了松散无规则的构象，易被水解，从而使蛋白质的物理、化学特性得以改善，提取率显著提高。因此，物理方法在提高提取率方面有很好的效果，如果将膨化和酶解法相结合，理论上会使大分子物质断裂得更为充分，更能增加水溶的概率。

因此，我想对鹿花盘提取方法进行改进，将鹿花盘膨化后，使用酶裂解的方法提取鹿花盘提取物，获得较高的提取率。最关键的部分是对提取物的特性进行研究，以验证提取效果，为鹿花盘的深加工建立新方法。

研究过程

膨化条件的优化

将鹿花盘用中药粉碎机粉碎后磨成细粉，分别过100目和300目筛子，制备成100目细粉和300目超微粉。分别称取等量鹿花盘块、100目鹿花盘粉、300目超微粉，使用单螺杆膨化机膨化，测定膨化样品的直径。以径向膨化率表示膨化度（径向膨化率一平均直径/模孔直径），并通过体视学显微镜测定未膨化和膨化鹿花盘粉的显微结构。本研究主要考查3个因素对鹿花盘膨化度的影响：温度、含水量、压强。

结果显示，本实验条件下最适宜的物料粒度为100目;根据不同温度、模头压强和物料含水量对鹿花盘膨化度的单因素影响，在本实验条件下最适宜的膨化温度为120℃、模头压强为4Mpa、物料含水量为25%。在这一条件下，经过水提法提取膨化鹿花盘粉（PP）有效成分提取率为30.23%，较未膨化鹿花盘粉（AP）的提取率提高了9.56%。

鹿花盘的酶解条件优化

选取胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶4种蛋白酶对AP和PP进行酶解，对单酶筛选中提取率最高的蛋白酶进行单因素条件优化。

PP对4种单酶的酶解提取率均高于AP。且在膨化和未膨化鹿花盘粉中，胃蛋白酶酶解鹿花盘的提取率最高，中性蛋白酶酶解的提取率最低。由此选择胃蛋白酶作为膨化鹿花盘单酶解和正交实验中的主要酶。随着料液比的增加，提取率持续增长且越来越平缓;当加酶量达到4%时，提取率最高，而后呈下降趋势;随着酶解时间的加长，提取率逐渐升高，考虑实际生产利用率等问题，选择2h、4h和6h作为酶解时间范围。

根据胃蛋白酶单因素条件摸索的范围，以提取率为评价指标，得到胃蛋白酶单因素提取范围：料液比1：30，酶解4h，加酶量4%，酶解温度37℃。利用最佳酶解条件对PP进行酶解，最终提取率达到36.39%。

鹿花盘胶原蛋白的特性研究

◇抗氧化活性测定实验

鹿花盘在治疗乳腺增生、抗疲劳、抗炎、镇痛等方面的功效显著，而这些疾病常常与人体产生的自由基及其诱导的氧化反应密切相关，清除自由基也被广泛认为可延缓人体衰老和预防疾病。因此，通过对不同提取方法的鹿花盘提取物进行体外抗氧化活性的测定，可以全面地了解和掌握鹿花盘抗氧化特性。

分别取AP的提取液（AB）、PP的提取液（PB）和膨化的鹿花盘酶解提取液（MB）作为样品，利用三氯化铁还原法和DPPH清除自由基法进行实验。结果发现，提取方法不同，3种鹿花盘提取物抗氧化能力略有不同，但均具有良好的抗氧化特性，其中膨化酶解后鹿花盘提取物抗氧化能力最强，膨化鹿花盘水提取物次之，未处理鹿花盘水提取物最弱。这说明鹿花盘的抗氧化活性可以随着提取方法的深入而呈现上升趋势，并且随着提取物浓度的增大，总还原力和DPPH自由基清除能力增强。

抗炎活性验证实验

鹿花盘具有显著的抗炎作用。本实验利用鹿花盘提取物对脂多糖（LPS）诱导的RAW264.7炎症模型进行作用。对比不同提取条件下的鹿花盘提取物对炎症细胞的影响。结果表明，不同的鹿花盘提取物能有效抑制LPS诱导的RAW264.7细胞炎症反应。其抗炎作用可能与释放NO、TNF-a、IL-1B和IL-6有关，且PB对抑制3种促炎细胞因子的效果更加显著。

线虫模型效果验证实验

本实验利用线虫，对不同方法处理后的鹿花盘提取物进行抗衰老、抗疲劳方面的效果验证，为后期相关鹿花盘产品的开发提供理论和数据支持。

·对线虫寿命的影响：本实验中我们选定的不同提取方式的鹿花盘提取物给药浓度均为1mg/mL，阳性对照白藜芦醇浓度为100uM。实验结果表明，AB组对线虫寿命没有显著影响，PB组和MB组均能明显延长线虫的寿命，且MB组的作用效果稍强于阳性对照白藜芦醇。

·对线虫运动的影响：实验第1～6天，各组线虫运动形式均为A型，第10天开始有所不同，给药组A型线虫均多于对照组。从第14天和第18天的结果可以看出给药组线虫的运动状态明显好于对照组，且PB和MB组线虫运动状态好于AB组。

·对线虫吞咽频率的影响：在线虫生命初期（第1～5天），给药组和对照组的吞咽频率无明显差异，第9～17天观察结束，给药组与对照组有显著差异（P<0.05）。说明不同处理方式的鹿花盘提取物均能不同程度地增强线虫的吞咽频率，提高晚期线虫生存状态，且PB和MB组效果好于AB组。

根据上述实验结果，鹿花盘提取物能明显延长野生型线虫的寿命，提高线虫的运动状态，在线虫生存晚期效果更加明显，鹿花盘提取物给药组A、B型线虫数目明显多于对照组。鹿花盘提取物能提高线虫吞咽频率，增强咽部吞咽能力，具有明显抗衰老、抗疲劳的作用，且鹿花盘膨化处理及酶解处理后效果更显著。

总结

本次研究创造性地将物理和生物化学方法相结合，设计了一套高效的鹿花盘提取方法，并对该方法的各个环节进行条件摸索和优化，通过离体模型（体外实验和细胞模型）和活体模型对鹿花盘提取物抗氧化、抗炎、延缓衰老和抗疲劳等功效进行了验证，发现通过粉碎、膨化、酶解后的鹿花盘提取物的效果明显好于传统提取方法。

◇通过粉碎、膨化、酶解3个步骤，将鹿花盘膠原蛋白的提取时间缩短到1天之内，提取率提高到了36.39%，相比鹿角块水煮的提取率提高了将近1倍，相比熬制鹿角胶耗时4～7天，药典记载的17%的提取率提高了1倍多。

◇确定了鹿花盘膨化的最佳提取粒度为100目，最佳膨化条件为膨化温度120℃、模头压强4Mpa、物料含水量25%。

◇最佳酶解提取方法为：使用胃蛋白酶酶解，料液比1：30，酶解4h，加酶量4%，酶解温度37℃。

◇分别通过离体、细胞和活体3种生物模型，递进式地对膨化酶解后的鹿花盘胶原蛋白特性进行分析。发现抗氧化特性提高了25%;同时显著提高了抑制炎性巨噬细胞释放NO的能力，且显著提高了抑制LPS诱导的RAW264.7细胞的炎症反应;显著延长野生型线虫的寿命，提高线虫的运动状态和抗疲劳的能力。

该项目获得第33届全国青少年科技创新大赛创新成果竞赛项目中学组生物医学组一等奖。

专家评语

本研究实用性强、思路清晰、设计合理，改装了装置，设计了提取流程和优化条件，提高了提取率。建议进一步细化提取流程。