秦伟斐，毕蕾静，李 维，黄 霞

(重庆市血液中心 400015)

目前，根据我国2015版《血站技术操作规程》中献血者血液传染性标志物筛查的规定，在实施核酸检测(NAT)试剂批签发之前，乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人类免疫缺陷病毒(HIV)感染标志物应采用1次核酸检测和2次酶联免疫吸附测定(ELISA)检测，ELISA检测应采用两个不同生产厂家的试剂；实施NAT试剂批签发之后，血清学方法和核酸方法即可各检测1次。对于ELISA检测阳性的标本可不再进行NAT，直接视为该项目检测结果不合格。然而，虽然采用2次ELISA检测，仍可因“窗口期”、隐匿性感染、基因变异及检测灵敏度不够高等因素造成一定程度的漏检[1-3]。NAT是直接检测病毒核酸，视为降低血清学窗口期漏检风险最直接、最可靠的方法[4]。本中心于2011年以科研项目的方式启动了部分献血者核酸筛查项目的试点，2013年1月开启对所有献血者血液进行NAT和血清学检测并行的模式。为了评估正式启动献血者核酸筛查后的效果，评价其在降低输血相关感染风险和保障血液安全中的作用，作者对2013-2017年本中心无偿献血者血液筛查结果进行回顾性分析，重点分析核酸筛查的结果，包括对比分析Procleix ULTRIO Assay和Procleix ULTRIO Plus Assay试剂的检测结果，以评估NAT在重庆献血者血液筛查中的收益情况，现将结果报道如下。

1 对象与方法

1.1对象 (1)标本来源：本中心2013-2017年共收集无偿献血者标本667 398份，分别采用乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝血真空无菌采血管，有分离胶的试管采集8 mL用于NAT和无分离胶的试管采集5 mL用于ELISA检测，标本处理过程严格按照说明书和标准操作规程执行。(2)试剂与仪器：HBsAg检测(英国索林、北京万泰)、HCV检测(美国强生、上海科华、北京万泰)、HIV-1/2检测(法国伯乐、上海科华)。NAT试剂：HBV、HCV、HIV(1型)NAT试剂盒及HBV、HCV、HIV-1鉴别探针试剂(西班牙Grifols公司)。全自动样品处理仪(Xan-Tus)；全自动酶联免疫分析系统(Microlab FAME24/20)；PROCLEIX TIGRIS 核酸检测系统(西班牙Grifols)；EXL808酶标仪(美国BIO-TEK)。

1.2方法

1.2.1检测方法 用于ELISA检测的5 mL标本经全自动样品处理仪加样完成后，分别采用两个不同厂家的试剂对同一项目在全自动酶联免疫分析系统上进行检测，HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2双试剂2次ELISA检测；同时，用于NAT检测的8 mL标本置于样品架，在自动生物安全开盖机内开盖，采用单人份NAT，基于转录介导扩增(TMA)的NAT法在Tigris 全自动核酸分析系统上进行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA 3项联检测分析，对NAT联检呈反应性的标本进行进一步鉴别检测。

1.2.2结果判定 所有检测结果判定依据严格按照试剂说明书及标准操作规程进行。ELISA检测时，当同一检测项目两种试剂检测结果均吸光度/临界值(S/CO)≥0.8，则直接认定该标本为反应性；如某一检测结果S/CO≥0.8，则用同一厂家试剂再次双孔复试，复试结果若任一孔S/CO≥0.8，则认定为有反应性，否则判为无反应性。NAT检测时，先用ULTRIO试剂进行HBV DNA、HCV RNA、HIV RNA检测，联检有反应性的标本，则判为NAT有反应性；再分别进行HBV、HCV和HIV-1鉴别检测，根据鉴别结果，判为某一项目的NAT有反应性。最后，再根据ELISA检测结果和NAT结果综合判断，NAT与ELISA均无反应性的标本为合格标本；NAT与ELISA均有反应性的标本为阳性标本；NAT无反应性而ELISA有反应性的标本为阳性标本，NAT有反应性而ELISA无反应性的标本也为阳性标本。

1.3统计学处理 数据采用SPSS21.0统计软件进行分析，计数资料以率表示，二者比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1ELISA与NAT结果呈反应性情况 2013-2017年共667 398份无偿献血者血液标本进行了2次ELISA筛查和NAT联检反应性，两种检测方法共检测呈反应性标本10 125份，总的反应性率为1.52%(10 125/667 398)。其中ELISA方法检测呈反应性标本7 975份，反应性率为1.19%(7 975/667 398)。NAT呈反应性标本5 979例，反应性率为0.90%(5 979/667 398)。不同年份检测总的反应性率比较差异有统计学意义(P<0.05)，其中2013、2014年检测总的反应性率分别为2.18%、2.12%；2015年开始采取了一系列改进措施，具有反应性的标本明显降低，2016年检测总反应性率仅为0.88%，为5年中的最低值，分别与2013、2014年比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

2.2ELISA与NAT反应性标本分布情况 10 125份反应性标本中NAT与ELISA均有反应性的标本3 829份，占总反应性标本的37.82%(3 829/10 125)，NAT与ELISA均有反应性率为0.57%(3 829/667 398)；NAT无反应性而ELISA有反应性的标本4 146例，占总反应性标本的40.95%(4 146/10 125)，单反应性率为0.62%(4 146/667 398)；NAT有反应性而ELISA无反应性的标本2 150例，占总反应性标本的21.23%(2 150/10 125),单反应性率为0.32%(2 150/667 398)。2016年开始采用新一代高灵敏度的Plus Assay试剂后，NAT+ELISA-明显增高，2016年和2017年分别与其他年份比较，差异有统计学意义(P<0.05)。ELISA和NAT结果见表2；2013-2017年核酸与ELISA检测获得的反应性标本中NAT+ELISA+、NAT-ELISA+、NAT+ELISA-的分布情况，见表3。

表1 不同年份ELISA筛查和NAT联检反应性情况

a：P<0.05，与2013、2014年比较

表2 ELISA和NAT结果(份)

表3 NAT与ELISA检测获得的反应性标本分布情况

a：P<0.05，与2016、2017年比较

2.3NAT联检反应性且ELISA检测非反应性标本鉴别情况 2 150例单NAT反应性标本，共鉴别检出反应性标本707份，鉴别率为32.88%(707/2 150)；其中HBV DNA反应性标本696份，HIV RNA反应性标本11份，无HCV RNA标本鉴别检出。NAT总确认收益率为1.06‰(707/667 398)，其中HBV DNA确认收益率为1.04‰，HIV RNA确认收益率为0.02‰,见表4。

表4 单核酸联检反应性标本鉴别情况[份(‰)]

3 讨 论

受血者感染输血传播病原体风险的大小与献血人群病原体感染率、献血者血液筛查方法及试剂敏感性、病原体特性、受血者个体免疫状态等多种因素有关。献血者血液筛查是保障血液安全的重要屏障。近几十年来，随着血液筛查试剂不断升级换代，检测设备更加精密和自动化，检测流程更加规范，血液安全水平明显提高。更高灵敏度和特异度的NAT技术在我国献血者血液筛查中已全面采用，目前尚缺乏对我国NAT应用效果的全面评价。

近年来，本血液中心采用Procleix ULTRIO®System和两种ELISA试剂同时对献血者血液标本检测，5年共检测血液标本667 398例，总反应性率为1.52%，高于其他地区报道[5]，NAT联检反应性率为0.90%，也明显高于国内其他学者报道[6-7]，可能与不同地区人群的总体感染率有关。唐卫国等[8]曾报告2000-2009年重庆市无偿献血者中，HIV感染率呈逐年上升趋势，说明重庆地区无偿献血者血液安全保障工作压力大。本研究结果显示，近5年来ELISA反应率和NAT联检反应率整体呈下降趋势，可能与近年来本中心在血液安全保障方面采取了一系列改进措施有关，如与加强了献血者献血前宣传教育，帮助献血者进行不适用献血的自我排除；采用了更灵敏的献血前筛查方法；逐步取消了互助献血者等因素有关。

667 398份检测样本中，NAT与ELISA同时呈反应性的标本占总反应性的37.82%，单NAT反应标本占总反应性标本的21.23%，单ELISA反应性标本占总反应性标本的40.95%。单NAT反应标本仅为0.32%，比吕蒙恩等[6]报道的0.44%略低；而ELISA单反应性标本反应性率为0.62%。作者曾经在对2015年献血者HBV筛查结果分析时发现，ELISA单反应性的HBsAg反应性标本中，两种ELISA试剂均有反应性的标本确证阳性率为78.7%，单试剂反应性的确证阳性率仅为5.3%[9]，提示ELISA单试剂呈反应性的标本中存在相当比例的假反应性。但是，在阻断输血相关传染性疾病的传播中，ELISA检测技术作为国家规定的血液筛查方法发挥着重要作用，尤其是ELISA和NAT两种方法联合检测[10]，互为补充，为进一步缩短“窗口期”发挥重要作用。

本研究NAT的鉴别结果显示，2 150例单NAT反应性标本，共鉴别检出反应性标本707份，其中HBV DNA反应性标本696份，HIV RNA反应性标本11份，无HCV RNA标本鉴别检出。NAT总确认收益率为1.06‰，略高于吕蒙恩等[6]、YANG等[11]的报道结果；其中HBV DNA确认收益率为1.04‰，明显高于美国和欧洲等地区献血者的HBV阳性率，这与我国乙型病毒性肝炎(乙肝)流行率较高有关；HIV RNA确认收益率为0.02‰，远高于林诗雅等[12]报道的30多万献血者中鉴别检出2例HIV；HCV RNA确认收益率为0，与国内大部分地区报道相一致。2017年本中心HBV DNA确认阳性率为1.63‰，明显高于其他年份，这与近年来本中心采用了新一代具有更高灵敏度的Procleix ULTRIO Plus Assay试剂有关。另外，NAT单反应性标本中鉴别率仅为35.90%，而大部分的标本未被鉴别检出，这是单人份NAT中常遇到的问题。未被鉴别检出这部分NAT单反应性标本有可能是多方面原因所致。一方面是与本中心现在采用的NAT方法有关，LINNEN等[13]研究发现TMA技术会导致检测结果呈假阳性；另一方面可能与标本病毒载量较低，鉴别检测时可能正好未吸取到病毒核酸而导致核酸鉴别假阴性有关。VERMEULEN等[14]曾报道NAT HBV反应性标本主要为隐匿性HBV感染，其次是窗口期HBV感染。高灵敏度检测试剂的使用，可以提高鉴别确认率，有利于提高对低病毒拷贝数HBV窗口期及隐匿性乙肝的检出率。本研究结果显示，本中心增加NAT应用以来，成功阻止了696份HBV DNA阳性和11份HIV RNA阳性血液发往临床,有效避免了经输血传播该病毒的风险。本中心对其中的4份HIV RNA阳性标本的献血者进行了追踪随访，确认为“窗口期”感染标本[15]。

综上所述，在重庆地区献血者血液筛查策略中增加NAT，可以极大地降低经输血传播病原体的残余风险，从而提高血液的安全性。