秦 汉 姜亨波 杨青文 秦 臻 石运芝

口腔医学院，山东第一医科大学(山东省医学科学院)，山东 泰安 271000

牙菌斑(dental plaque)是口腔中不能被水冲去或漱掉的细菌性斑块，是由基质包裹的互相黏附或黏附于牙面、牙间或修复体表面的软而未矿化的细菌性群体[1]。牙菌斑作为龋齿四联因素中起主导作用的一个因素，它通过与糖反应持续产酸，致使牙釉质脱矿，而产生龋齿[2]。因此，减少牙菌斑成为实现有效防龋的重要靶点。

氟化物因能促使早期釉质病损再矿化、杀灭致龋菌和阻止致龋菌代谢糖产酸而成为重要的防龋物质[1]。目前常用氟化物有8%氟化亚锡、75%氟化钠甘油糊剂及含氟涂料等。氟化物虽然具有对软组织无腐蚀性、不使牙变色等优点，但因摄入过高的氟会引起人体慢性氟中毒，并且长期使用可导致耐受菌株的产生[2]，因此我们的目的是寻找一种能与氟化物起协同作用的药物，进而减少氟化物的用量，避免氟化物中毒。氟化钠(NaF)作为一种重要的氟化盐，常用来制造其它氟化物，但对NaF防龋作用的研究报道较少。

2007年日本学者Ohsawa报道，动物呼吸2%的氢气可选择性中和羟自由基和亚硝酸阴离子，显著改善脑缺血再灌注损伤[3]。氢气(hydrogen)，作为一种无毒、容易制备且具有选择性抗氧化作用的气体，具有潜在的临床应用前景。 Kim J等发现富氢水能有效抑制体外链球菌菌斑生物膜的形成[3]。氢化镁(MgH2)是一种白色结晶的化学物质，与水反应放出氢气，MgH2+H2O=H2↑+Mg(OH)2。鉴于此，本实验以大鼠为研究对象，采用体内菌斑染色和体外药敏试验方法，检测氟化钠和氢化镁的抗牙菌斑作用，并分析可能的生物学机理。

1 资料与方法

1.1 实验动物

选取健康成年Wistar大鼠24只，体重(220±20)g，购自济南朋悦公司，常规饲养，通风清洁，光照12 h，适应1周后开始试验。

1.2 实验试剂

氢化镁、氟化钠(上海瀚思化工有限公司)，水合氯醛(天津市大化学制剂厂)，TPY琼脂培养皿(青岛高科园海博生物技术有限公司)，TSB胰蛋白胨大豆肉汤(青岛高科园海博生物技术有限公司)，菌斑染色剂-碱性品红(日进齿科材料有限公司)。用打孔机将空白滤纸制作成直径为5 mm的空白纸片，高温消毒后备用。

1.3 实验步骤

1.3.1实验分组与牙菌斑采集

将24只Wistar大鼠随机分为4组(每组6只)：对照组、MgH2组、NaF组、NaF+MgH2组。各组大鼠分别进行编号，保证菌斑染色试验效果与药敏试验为同一个研究对象，减少实验误差。实验组大鼠每天饲喂普通颗粒饲料和高糖水(60%)。20天后，用菌斑染色剂检测大鼠磨牙舌面与牙合面菌斑的形成情况，在牙合面窝沟点隙用标准取菌环法采集牙菌斑，轻刮取菌斑，剪下无菌环放入装有1 mL生理盐水的无菌瓶中，密封送实验室，稀释后移入TSB增菌液中，37℃恒温箱中培养备用。

1.3.2菌斑染色实验

对照组以生理盐水涂抹大鼠下颌左右第一与第二磨牙的舌面与牙合面，然后用蘸有菌斑显示液的小棉球在上述部位进行涂抹，蒸馏水冲洗后，进行拍照、记录；实验组中，对大鼠相应牙齿进行药物涂抹20天后，采用同样的方法检测大鼠的牙菌斑数量，并进行拍照、记录。

菌斑计数指标的测量，参照Rustogide[5]菌斑计数法进行。计分标准：0=龈缘区与牙合面无菌斑；1=龈缘区的牙面有薄的菌斑，但视诊不可见，若用探针尖的侧面可刮出菌斑；2=在龈缘或牙合 面可见中等量菌斑；3=龈沟内或龈缘区及牙合面有大量软垢。菌斑指数=牙齿各区域菌斑计数之和/牙区域总数。

1.3.3药敏试验

实验前临时配制170 mg/mL的氢化镁、170 mg/mL氟化钠以及两者的等比例(1∶1)混合物溶液。采用无菌棉将TSB增菌液中的细菌分别均匀涂抹于普通培养基上，用无菌镊子按照实验分组夹取空白纸片，在上述溶液中充分浸泡后，快速放入培养皿，置37℃恒温箱中培养24 h后取出，观察、测量抑菌圈的直径。

1.4 统计学方法

所有数据均采用均数±标准差表示，应用SPSS15.0统计软件，对所得数据进行统计分析，P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 在体菌斑染色结果

菌斑显示液涂抹、蒸馏水冲洗后，着粉红色的区域即为菌斑存在区(图1)，阳性着色主要见于大鼠下颌左右第一与第二磨牙的牙合面和舌面近牙龈缘。对照组在牙合面可见中等量菌斑，龈缘区的牙面与牙合面有薄的菌斑(图1)。菌斑指数统计结果显示，氢化镁与氟化钠联合用药的菌斑指数明显低于单独应用氢化镁或氟化钠组，且差异具有统计学意义(P<0.05)(表1)。

表1 不同实验组大鼠牙菌斑指数和抑菌圈直径

注：同一列中上标不同小写字母表示差异具有统计学意义，P<0.05。

A.对照组；B.MgH2组；C.NaF组；D.NaF+MgH2组。

2.2 体外药敏实验结果

应用TPY培养基培养的大鼠牙菌斑，在相同剂量浓度下，氢化镁抑菌圈直径小于氟化钠(表1)，但差异无统计学意义。研究还发现，在氢化镁的药敏试验中，抑菌圈内部出现散在的菌落(图2)，推测可能为耐药株；氢化镁与氟化钠联合用药的抑菌圈直径明显大于单独应用氢化镁或氟化钠组(表1，图2)，且差异具有统计学意义(P<0.05)，提示氢化镁与氟化钠联合具有良好的协同作用，能够有效抑制大鼠牙菌斑的生长繁殖。

A.对照组；B.MgH2组；C.NaF组；D.NaF+MgH2组。

3 讨 论

牙菌斑是龋病发生的始动因子，在pH 7～4范围内，pH每降低一个单位，羟基磷灰石的溶解性便可增加7倍，细菌的产酸能力及乳酸脱氢酶活性能直接影响致龋能力[6]。氟化钠是目前常用的防龋物，但其摄入量无法准确控制，有报道[7]称当氟摄入量超过6 mg/d时，可以导致氟化物中毒。本实验选用170 mg/mL 浓度的氟化钠与氢化镁进行联合使用，观察其对混合菌种牙菌斑繁殖的影响，并与单独使用氢化镁或氟化钠进行比较。菌斑染色结果显示，实验组菌斑指数明显低于对照组(P<0.05)，且NaF+MgH2组菌斑指数显著低于MgH2组和NaF组(P<0.05)，提示氢化镁与氟化钠的联合用药能够有效的减少大鼠牙齿上的牙菌斑的数目且对牙菌斑的抑制效果要大于单独使用氢化镁或氟化钠。在药敏试验中我们发现当对照组氟化钠浓度为170 mg/mL 时，可出现一个直径为(14.80±2.12)mm的明显抑菌圈，证明氟化钠可以抑制牙菌斑中细菌的生长。相关文献中也曾报道，氟化物可以通过释放出来的氟离子抑制多糖、脂磷壁酸等大分子物质的合成来发挥其灭菌、产酸抑菌作用，进而使牙菌斑内细菌(包括致龋菌)的数量减少[8]。Sjögren[9]的体外实验也表明，用1.5 ml/L的氟可抑制菌斑产酸，使菌斑pH值明显升高。在氢化镁的对照组中抑菌圈的直径为(11.00±1.10)mm，但是抑菌圈周围有散在的小菌落，考虑可能为耐药菌，但是实验结果仍说明氢气也具有抑制牙菌斑繁殖的能力，与之形成对比的是实验组中，氢化镁与氟化钠混合试剂抑菌圈直径最大(P<0.05)，表明氢化镁与氟化钠混合试剂具有协同抵抗牙菌斑生长的能力且药效大于单独使用氟化钠或氢化镁。

目前已有的研究中对人类口腔中牙菌斑成分已有了清楚的认识，但有关大鼠牙菌斑的构成却有待进一步研究，且导致大鼠致龋的机理也不明确，我们在李岩涛等[10]的研究结论中发现，尽管人和大鼠口腔中细菌所占比例不同，但是牙菌斑中的优势菌仍为链球菌和放线菌，各自所占比例大约为41.23%和52.5%，提示大鼠致龋的机理应与人类口腔致龋的机理基本一致，均可能是通过细菌无氧活动来进行产酸，然后作用于牙釉质表面的羟基磷灰石而致龋。马宏等研究发现，在细菌对牙面的吸附早期，氟可以通过竞争性地与Ca2+结合，使细菌与牙面之间不能以“钙桥”的方式结合，同时使游离菌与已粘附菌之间的连接作用减弱，有利于唾液的清除；氟还可作用于某些代谢醇而影响细菌细胞内的糖酵解过程，抑制产酸作用[11]。我们的研究结果证明，氟化钠具有减少牙菌斑的作用，推测可能通过相似的机理。

综上所述，本研究发现氢化镁与氟化钠均对牙菌斑有显著抑制作用，并且联合应用具有协同作用，比单一使用氟化钠或氢化镁效果更佳。另外，本实验仅是初步研究，许多环节，如氢化镁产生氢气的同时释放出来的少量氢氧化镁，是否也发挥一定的作用，氟化钠与氢化镁联用的最佳效应剂量等，都有待于进一步研究。