吴磊 罗华伦 张依裕 覃媛钰 向程举 吴学树

摘要：为进一步了解长顺绿壳蛋鸡FGF23基因的遗传效应，试验随机抽取同日出雏、健康无病、同等管理条件下饲喂10周龄的100只长顺绿壳蛋鸡，翅静脉采血，提取DNA，采用混合基因池进行PCR扩增，结合直接测序法对FGF23基因进行单核苷酸多态性（SNP）筛查。结果表明，在长顺绿壳蛋鸡FGF23基因启动子区共筛查到3个SNP突变位点（g.73424388，T>C;g.73424577，TC），其中，g.73424388和g.73424660两个突变位点呈中度多态，g.73424577呈低度多态，说明长顺绿壳蛋鸡在自然群体中的遗传多样性较为丰富。

关键词：长顺绿壳蛋鸡;FGF23基因;单核苷酸多态性;抗逆性

中图分类号：S831.2         文献标识码：A

文章编号：0439-8114（2019）16-0107-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2019.16.024           开放科学（资源服务）标识码（OSID）：

Abstract： To further understand the genetic effects of the FGF23 gene in Changshun green shell，100 random long-green hens fed with 10 weeks old were randomly selected from the same time， healthy and disease-free， under the same management conditions. Blood was collected from the wing veins， DNA was extracted， and PCR was performed using a mixed gene pool. Direct sequencing method was used to study the single nucleotide polymorphism（SNP） screening of FGF23 gene. Results showed that three SNP mutation sites were screened in the promoter region of FGF23 gene in Changshun green shell（g.73424388，T>C;g.73424577，TC） Among them， g.73424388 and g.73424660 two mutation sites are moderate polypeptides， and g.73424577 is a low polypeptide. It showed that the genetic diversity of Changshun green shell hens is abundant in natural populations.

Key words： Changshun green shell hen; FGF23 gene; single nucleotide polymorphism; resistance

成纖维细胞生长因子（Fibroblast growth factor，FGF），又称肝素结合生长因子（Heparin binding growth factor），是一类具有广泛生物学活性的肽类物质，是多能信号分子，具有参与细胞增殖、分化和游走等功能[1]。截至目前，成纤维细胞生长因子共鉴定出23种，包括人类和鼠的FGF（人类FGF15和鼠FGF19尚未被相关研究证实），这23种成纤维细胞生长因子（FGF1～FGF23）均属于FGF家族成员。成纤维细胞生长因子家族中的这些成员参与调节众多生长发育过程，特别是在细胞保护、血管再生及促有丝分裂领域已得到开发与应用，根据其系统发育以及同源性的不同，还可以将FGF分为多个亚家族[2]。FGF存在于脊椎动物和无脊椎动物体内，其含有2个内含子和3个外显子，这是FGF家族因子的典型特征[3]。FGF23由成骨细胞等肾外组织合成和分泌，对机体内很多腺体及器官，如胸腺、甲状腺、甲状旁腺及心脏、肝脏等都有作用[4]。本研究通过筛查长顺绿壳蛋鸡FGF23基因启动子区多态性、计算其等位基因频率和PIC并进行分析等工作，结合FGF23及其基因多态性在人体内对骨骼发育、血磷稳定等的影响，从而推测其在家禽体内的作用，为进一步了解家禽机体血磷稳定、保障家禽机体健康、家禽选种育种提供参考，对促进家禽业的良好发展具有重要的意义。

1  材料与方法

1.1  材料

1.1.1  试验动物  长顺绿壳蛋鸡随机采样于贵州大学动物科学学院农场（100只：♂50，♀50），采样方法为翅静脉采血，每只采血1.0～1.5 mL，保存于普通生化管内（无抗凝剂条件下）静置斜放，用移液枪把析出的血清转移到离心管内离心直至样品清澈透亮，样品放置于-20 ℃保存备用。

1.1.2  主要试剂  全血DNA提取试剂盒购于天根生化科技有限公司;2×Taq PCR Master Mix试剂和琼脂糖购自北京康为世纪生物科技有限公司;DM2000 购自重庆擎科生物科技有限公司。

1.1.3  主要仪器  电泳仪（DYY-2C），北京市六一仪器厂;化学发光荧光全自动分析成像仪（Biosens SC710），上海山富科学仪器有限公司;梯度PCR仪（PTC200），美国Bio-Rad公司;电子天平（BL-320H），日本津岛公司;高压灭菌锅（HRLM-80），中国海尔集团。

1.2  方法

1.2.1  基因组DNA的提取  全血基因组DNA的提取方法，参照天根生化科技（北京）有限公司生产的血液/组织/细胞基因组提取试剂盒（DP304）内所附的操作说明书，在实际操作中可以根据具体情况稍作修改（如适当延长离心次数和离心时间、适当增加或减少操作步骤中试剂的用量），但要保证所提DNA的质量。1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，NANODROP 2000 DNA浓度测定仪（美国Thermo Scientific公司）测定浓度。

1.2.2  引物合成及目的片段扩增  根据鸡基因mRNA序列（GenBank登录号：NC_006088.4）设计1对引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反应体系：1 μL基因组DNA模板，上游引物和下游引物各1 μL，10 μL 2×Es Taq Master Mix，7 μL RNase-Free Water，总体积为20 μL，反应程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃变性50 s，60 ℃退火50 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环;72 ℃延伸5 min。待反应结束后，将PCR反应产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.2.3  SNP筛查和统计分析  利用相关的生物信息学分析软件，如DNA STAR、MW snap等对FGF23基因测序结果进行SNP筛查，寻找突变位点并计算等位基因频率。参照李万贵等[5]、潘兰兵[6]的方法，运用DNA STAR等生物软件进行序列拼接、比对、筛查多态位点;统计各等位基因频率、基因型频率。利用SPSS软件处理分析，并计算位点纯合度（Ho）、杂合度（He）、有效等位基因数（Ne）、多态信息含量（PIC）等。

2  结果与分析

2.1  基因组DNA提取检测结果

按照试剂盒内操作提取3个鸡品种所有个体的全血基因组DNA，其完整性通过1%的琼脂糖凝胶电泳进行检测。由图1可以看出，所提的DNA完整性较好，经荧光全自动分析成像仪及DNA浓度检测仪检测。结果表明，OD260 nm/OD280 nm的比值为1.8～2.0，DNA纯度较高，可用于下一步試验。

将提取所得的DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，所得结果如图2所示。由图2可知，经过PCR扩增所获得的目标片段呈现单一、明亮的条带，且PCR扩增产物与预期片段大小相符，检测结果显示PCR扩增产物可用于下一步试验研究。

2.2  FGF23基因SNP（单核苷酸多态性）筛查

通过DNA混合池结合直接测序的方法，运用DNA STAR等软件进行分析后，在鸡FGF23基因的启动子（73424155～73425413）区域共检测到3个SNP位点。每个突变位点上的碱基突变为第g.73424388位碱基发生（T>C）突变、第g.73424577位碱基发生（T

2.3  FGF23基因启动子区SNP部分遗传特性分析

通过对3个SNP位点进行分析统计后所得出的结果见表2。由表2可知，长顺绿壳蛋鸡FGF23基因启动子区g.73424388位点上发生T/C突变，等位基因频率分别为0.443和0.567，位点杂合度（He）为0.491，杂合性较高;多态信息含量（PIC）为0.370 4，属于中度多态;在g.73424577位点发生T/C突变，等位基因频率分别为0.950和0.050，位点杂合度（He）为0.095，杂合性较低;PIC为0.090 5，属于低度多态;在g.73424660位点发生C/G突变，等位基因频率分别为0.443和0.567，位点杂合度（He）为0.491;PIC为0.370 4，属于中度多态。3个突变位点有效等位基因数（Ne）分别为1.965、1.105和1.965，群体分布较均匀。

3  讨论

目前，有关FGF23基因在家禽方面的研究报道十分少见，对于FGF23及其基因的绝大部分研究为其与人体的机体发育、新陈代谢、人类健康和疾病之间的相关性[5]，也有一些该基因在实验动物（如鼠）体内进行相关研究的文献和报道。本研究以长顺绿壳蛋鸡为试验材料，首次在FGF23基因启动73424155～73425413区域共检测到3个SNPs位点，第g.73424388位碱基发生（T>C）突变、第g.73424577位碱基发生（T

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