黄欣昊， 柳千帆， 宋春灼， 朱海涛

(1.贵州医科大学 临床医学院， 贵州 贵阳 550004； 2.贵州医科大学附院 肝胆外科， 贵州 贵阳 550004； 3.贵州医科大学附院 临床研究中心， 贵州 贵阳 550004)

胰腺癌是中国发病率居前10位、癌症致死位列第7的恶性肿瘤，全世界每年预计有227 000人死于胰腺癌[1-2]。虽然近年来胰腺癌的诊疗取得了一定的进展，但晚期患者的5年生存率仍然只有3%[3]。目前手术切除治疗是唯一可以治愈胰腺癌的技术手段，但仅限于病灶未扩散到胰腺之外的患者，且有80%～85%的晚期患者无法应用手术治疗[2,4]。大多数化学制剂对于胰腺癌的效果也十分有限[5]，吉西他滨(gemcitabine，GEM)是目前胰腺癌化学治疗的一线首选药物，但并不能明显提高患者的生存时间，单独使用时患者还易出现对药物的抵抗，至今抵抗机制尚不明确[6-9]。因此，联合使用其他的药物治疗胰腺癌是目前推荐的解决方案，表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)抑制剂厄洛替尼(erlotinib，ERL)联合GEM是临床上常用的分子靶向药物的联用方案[2,7]，与单用GEM相比，联合ERL的治疗方案可以延长患者的生存时间，但其效果以及作用机制还有待进一步研究[10-11]，本研究分别通过单独使用GEM、ERL，或两种药物联合用药，观察药物对胰腺癌细胞的毒性作用以及细胞克隆形成情况，探寻对胰腺癌治疗的新方案。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1细胞株、药物及试剂 人胰腺癌细胞PANC-1细胞由中国科学院干细胞库提供，GEM、ERL购自美国Selleck Chemicals公司，DMEM高糖培养基购自美国GIBCO公司，胎牛血清购自以色列Biological Industries公司，0.25%胰酶溶液(含0.02%EDTA)购自美国GIBCO公司，PBS 购自美国Hyclone公司， DMSO购自美国Hyclone公司，CCK-8细胞毒性试剂盒购自上海东仁生物技术公司。

1.1.2主要仪器 Navios三激光10色流式细胞分析仪购自美国BECKMAN公司，Optima XPN-80超高速离心机购自美国BECKMAN公司，371型细胞培养箱购自美国thermo公司，AB2-4S1型生物安全柜购自新加坡艺思高科技公司。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及药物配制 所有物品均灭菌处理，在紫外线照射消毒30 min后的生物安全柜中进行细胞操作。人胰腺癌PANC-1细胞置于37 ℃的5% CO2恒温潮湿环境中培养、分化，每2～3 d用无菌PBS磷酸缓冲液清洗，换新鲜完全培养基，PANC-1细胞处于细胞对数生长期，长满至80%时进行细胞传代，以保证实验所用的细胞均为对数生长期的PANC-1细胞。将GEM、ERL低速离心3 min后，GEM用无菌的PBS磷酸化缓冲液稀释，ERL用DMSO稀释，稀释后的药液避光保存在-20 ℃冰箱中。

1.2.2细胞分组 取对数生长期的PANC-1细胞。进行如下干预： GEM各浓度组(0、10、20、50、100及250 nmol/L)、ERL各浓度组(0、10、20、50、100及200 nmol/L)；GEM+ERL各浓度组(GEM ∶ERL浓度比分别为1 ∶1、1 ∶5、1 ∶10、1 ∶20及1 ∶50)。在细胞平板克隆实验中设立：对照组(无药物处理)、GEM干预组[GEM的半数抑制浓度(IC50)]、ERL干预组(ERL的IC50)、联合组(两种药物合用的浓度根据实验确定)。分别用相应浓度的含药培养基培养PANC-1细胞24 h。

1.2.3GEM或ERL单独应用对PANC-1细胞毒性实验 取对数生长期的PANC-1细胞，用0.25%含EDTA胰酶消化，离心后轻轻吹打成单细胞悬液，并进行细胞计数。以每孔5 000个细胞接种至96孔细胞培养板中，放入37 ℃的5% CO2恒温培养箱中培养；待细胞长至80%，换无血清培养，分别将含有GEM(0、10、20、50、100及250 nmol/L)、或ERL(0、10、20、50、100及200 nmol/L)的培养基加入96孔细胞培养板中，培养24 h，避光加入10%的CCK-8液，避光37 ℃孵育2 h，用化学酶标仪在波长为450 nm的波长下检测、记录吸光度值(Optical density，OD)，并计算药物对细胞的抑制率[抑制率=(对照组OD-实验组OD)/(对照组OD-实验组OD)×100%]，通过GraphPad Prism 7.0软件绘制两种药物各自对细胞的抑制率曲线，并计算各自的IC50。

1.2.4GEM及ERL联合应用对PANC-1细胞毒性试验 为了探究药物组合，本研究通过设置多种不同浓度的GEM与ERL组合比例，并采用CCK-8细胞毒性法检测GEM与ERL联合应用时对PANC-1细胞的抑制情况。在先前描述的条件下接种细胞，但此处用于评估的药物干预剂量是基于每种单独药物的IC50制定的。在每个平板中两种药物的组合保证大于2种，并重复至少2次。采用Chou-Talalay联合指数(combination index，CI)法计算CI[CI=(A药单用浓度/A药联用浓度)+(B药单用浓度/B药联用浓度)]分析两种药物合用时药物相互作用的性质，Chou-Talalay法规定CI<1药物组合有协同作用，CI=1药物组合有加成作用，CI>1药物组合有拮抗作用；同时根据Chou-Talalay的等效原则，仅选择GEM与ERL合用抑制率50%的组合与2种单药的IC50进行研究分析[12-13]。

1.2.5细胞克隆实验 将PANC-1细胞设置为无干预组(对照组)、GEM组、ERL组、GEM联合ERL组(联合组)分别进行干预。对照组无任何药物处理，GEM组或ERL组药物干预浓度分别为各自的IC50，联合组中GEM及ERL的药物浓度取决于药物联合分析实验。将细胞对数生长期PANC-1细胞，制成单细胞悬液，取6 000个细胞均匀接种于6孔板中，放入细胞培养箱中培养。待细胞贴壁稳定生长后，根据不同处理组各自的相应药物浓度继续培养细胞，培养12 d后用4%多聚甲醇固定30 min，再加入0.25%结晶紫染液室温静染45 min。用相机拍照保留结果，通过Image J软件处理图像并计算细胞克隆数。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 GEM或ERL对PANC-1细胞的毒性

用GraphPad Prism 7.0软件绘制两种药物分别对细胞的抑制率曲线，并计算得出GEM对PANC-1细胞的IC50=80 nmol/L，ERL对PANC-1细胞的IC50=12 nmol/L。见图1。

图1 GEM或ERL对PANC-1细胞的抑制率Fig.1 Inhibition rate curves of GEM or ERL to PANC-1 cells

2.2 GEM和ERL联合应用对PANC-1细胞的毒性

将GEM与ERL进行多种不同比例的浓度组合用于PANC-1细胞，结果显示，ERL ∶GEM的浓度比为5 ∶1时，对PANC-1细胞的抑制率接近50%，高于浓度比1 ∶1和10 ∶1，且差异均有统计学意义(P<0.05)，见表1。因此选择GEM与ERL5 ∶1组合用于后续实验。根据Chou-Talalay法分析结果可以得知，在PANC-1细胞中，GEM与ERL合用CI=0.4，药物合用有协同作用。

表1 不同浓度比例GEM与ERL联合应用对PANC-1细胞的抑制率Tab.1 The inhibition rate of PANC-1 cells by a combination of various ratios of GEM and ERL

注：(1)与GEM和ERL浓度比为5 ∶1时比较，P<0.05。

2.3 细胞克隆

与对照组比较，GEM组、ERL组、GEM和ERL联合组的PANC-1细胞克隆数均显著下降，差异均有统计学意义(P<0.01,或P<0.000 1)；GEM和ERL联合组PANC-1细胞克隆数显著低于GEM组和ERL组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

注：(1)与联合组比较，P<0.05；与对照组比较，(2)P<0.01，(3)P<0.000 1。图2 GEM、ERL单独或联合应用对PANC-1细胞的细胞平板克隆的影响Fig.2 Cellular plate cloning results of drugs intervention in PANC-1 cells

3 讨论

部分胰腺癌患者在确诊时病情已经发展到了终末期，错失了手术机会，即使是有手术治疗机会，患者也面临着术后的高复发率[14-15]。已有研究表明，术后检测切缘分级为0级的患者，2年后胰腺癌的复发率依然可以高达80%[4]。尽管近年来，化疗方案在胃肠道等消化系统肿瘤的治疗上取得了较大进展，但胰腺癌仍然对大部分化疗方案不敏感，甚至出现耐药的情况[5]。寻找新的胰腺癌药物治疗方案，了解胰腺癌可能的分子机制是目前研究的重中之重。GEM是目前胰腺癌化疗的首选药物，它是脱氧胞苷的水溶性类似物，可以通过抑制DNA双链的合成、修复来抑制细胞的分裂与增殖，从而抑制肿瘤的生长，但治疗效果有限，即使采用了周密的全身性支持治疗，患者在治疗晚期依然会对GEM出现的耐药情况[15-18]。因此，目前改善GEM治疗效果的主要策略是将GEM与靶向或细胞毒性药物联合使用[6,11]。ERL是首个经美国食品药品监督管理局(food and drug administration，FDA)批准的、可与GEM联用后促进患者生存期出现优势的药物，是一种具有选择性的靶向可逆性抑制EGFR受体的小分子酪氨酸激酶抑制剂[6,11]。研究表明，大部分胰腺癌中EGFR的表达都有明显上调[19-21]，且ERL的抗肿瘤性与抑制EGFR的表达有着密切联系[18]。本课题组前期研究表明，GEM联合ERL治疗裸鼠转移性胰腺癌时，可有效地抑制肿瘤的发生发展[22]。本次研究结果显示，通过Chou-Talalay法进行药物联合分析GEM联合ERL有协同效应。Carolina等[23]的研究结果与本研究结果类似。细胞克隆形成实验表明，GEM联合ERL可以抑制胰腺癌的发生发展，且优于GEM和ERL的单独使用效应，该结果与本课题组前期裸鼠的实验研究结果趋势相同[22]。

综上所述，GEM和ERL联合使用具有协同作用，降低了两种药物的使用剂量，同时加强了抑制胰腺癌细胞增殖的效果，从而为胰腺癌治疗中GEM与ERL联合治疗提供了初步的科学依据，也为胰腺癌治疗的研究提供了较有价值的潜在方向。