王成强，李宝山*，王际英，黄炳山，郝甜甜，孙永智，马长兴，周莹

（1.山东省海洋资源与环境研究院，山东省海洋生态修复重点实验室，山东 烟台 264006；2.上海海洋大学水产与生命学院，水产科学国家级实验教学示范中心，上海 201306）

随着水产养殖集约化的不断发展，养殖生态环境日益恶化，病害频发，而抗菌药物的滥用使得水产养殖业面临着非常严峻的考验。为此，许多研究者致力于各种抗菌药物替代品的研究，益生菌（乳酸菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌等制剂）因具有安全性高、促进动物生长、提高机体免疫能力及改善水质等优点，成了近年来的研究热点[1]。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）因抗逆性强、稳定性高和产酶能力强，对水产动物的生长和免疫具有促进作用，并且能够改良水质，近年来被广泛应用[2-4]；酵母培养物（yeast culture）具有无毒副作用、不产生耐药性且可部分替代抗生素等优点，同时含有丰富的维生素、有机酸、氨基酸等营养物质，不仅能够提高动物生长性能、降低饲料系数，还可以优化动物肠道微生物菌群结构，改善肠道健康状况[5-6]。

本研究拟从健康珍珠龙胆石斑鱼（Epinephelus fuscoguttatus♀×Epinephelus lanceolatus♂）肠道中提取分离枯草芽孢杆菌，发酵制成枯草芽孢杆菌菌剂，配合酵母培养物添加到饲料中，饲喂珍珠龙胆石斑鱼幼鱼。通过它们摄食不同配比的枯草芽孢杆菌和酵母培养物饲料，研究珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的生长性能、体组成及养殖水质的变化情况。研究结果可为饲料中2种添加剂的使用量提供一定的理论数据，为通过饲料中添加微生态制剂调节养殖水质的可行性提供理论参考，为今后生物饲料的发展奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用枯草芽孢杆菌菌剂由山东省海洋生态修复重点实验室制备。从健康珍珠龙胆石斑鱼肠道细菌中分离和培养枯草芽孢杆菌菌种，并进行发酵生产，制成干菌粉（活菌数2.0×109CFU/g），以玉米淀粉为载体，作为饲料添加剂，具体步骤参考贺国龙等[7]的研究方法，并稍作修改。根据珍珠龙胆石斑鱼营养需求，配制含粗蛋白52.50%、粗脂肪11.63%的基础饲料。分别在基础饲料中添加0（B0）、0.5%（B1）、1.0%（B2）的枯草芽孢杆菌制剂，同时在每个枯草芽孢杆菌水平分别添加0（Y0）、0.5%（Y1）、1.0%（Y2）的酵母培养物（主要成分为蛋白质、氨基酸、多肽、核酸、β-葡聚糖、甘露糖、芳香物及未知生长因子等，由徐州赛博生物科技有限公司提供），共制成9组等氮等脂的试验饲料，分别记为 Y0B0（活菌数 0）、Y0B1（活菌数 4.15×106CFU/g）、Y0B2（8.04×106CFU/g）、Y1B0（0）、Y1B1（4.03×106CFU/g）、Y1B2（7.95×106CFU/g）、Y2B0（0）、Y2B1（3.89×106CFU/g）、Y2B2（8.24×106CFU/g），以Y0B0组为对照组。基础饲料配方及营养成分见表1。

表1 基础饲料配方及营养成分（干物质）Table 1 Basic formula and nutrient composition of experimental diets(dry matter)

制作饲料时，微量成分添加采取逐级扩大法，先将所有原料粉碎后过80目标准筛，按配比称量后混匀，加入鱼油与干粉充分混匀，之后加入适量的蒸馏水混合均匀，最后用小型颗粒饲料挤压机制成2种型号(直径分别为2.5 mm和3.5 mm)的饲料颗粒，在60℃条件下烘干，用饲料袋包装后，置于通风干燥处储存，备用。

1.2 试验用鱼及养殖管理

养殖试验在山东省海洋资源与环境研究院东营实验基地循环水养殖系统中进行，试验用鱼为该基地当年繁育的同一批珍珠龙胆石斑鱼幼鱼。养殖试验开始之前，先用对照组饲料暂养15 d，使其充分适应养殖环境。正式试验前，将试验鱼饥饿24 h，挑选大小均匀、体色健康的珍珠龙胆石斑鱼幼鱼[平均体质量为（23.41±0.47）g]，随机放养于18个养殖桶（70 cm×80 cm）中，每个桶内放30尾幼鱼，每个试验组设置3个重复，试验周期为8周。养殖期间，每天8：30和16：30各饱食投喂1次，投喂30 min后吸出残饵，并记录残饵数量。养殖期间水温控制在（28±1）℃，溶解氧＞6.3 mg/L，盐度为23.5～26.5，用氧气泵持续增氧。

1.3 生长指标分析

在8周养殖试验结束后，将试验鱼饥饿24 h，从每个养殖桶内将试验鱼全部捞起，进行称量、计数，并分别计算存活率、特定生长率、摄食率、饲料效率、蛋白质效率。公式如下：

存活率（survival rate,SR）=终末尾数/初始尾数×100%；

特定生长率（specific growth rate,SGR）=（ln终末体质量－ln初始体质量）/试验天数/d×100%；

摄食率（feeding rate,FR）=摄食量/g×2/[（终末体质量/g+初始体质量/g）×试验天数/d]×100%；

饲料效率（feed efficiency,FE）=（终末体质量/g－初始体质量/g）/摄食饲料干质量/g×100%；

蛋白质效率（protein efficiency ratio,PER）=（终末体质量/g－初始体质量/g）/蛋白质摄入量/g×100%.

1.4 饲料及全鱼常规营养成分测定

饲料及全鱼的水分含量采用在105℃条件下烘干至恒量法（GB/T 6435—2006）测定；粗蛋白质含量采用凯氏定氮法（GB/T 6432—2006）测定；粗脂肪含量采用索氏抽提法（GB/T 6433—2006）测定；粗灰分含量采用马弗炉在550℃条件下失重法（GB/T 6438—2007）测定。

1.5 水样采集及指标测定

从试验中期（第29天）开始封闭循环水，充气养殖12 d，其间正常投喂，同样在投喂30 min后吸出残饵，并记录残饵数量，同时补充水量至规定水位。分别在封闭循环水后的第3、6、9、12天取水样，方法如下：充分混匀养殖桶内水体，在离水面15 cm处取水样，用来分析水体中氨氮、亚硝酸盐含量和化学需氧量。12 d之后，恢复循环水养殖，直至试验结束。水样的氨氮、亚硝酸盐含量和化学需氧量的测定分别采用纳氏试剂法、重氮偶氮光度法和酸性高锰酸钾法[8]。

1.6 数据统计分析

采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。以枯草芽孢杆菌和酵母培养物添加量为影响因素，进行双因素方差分析（two-way ANOVA），且交互作用不显著时，分析枯草芽孢杆菌和酵母培养物的主效应。另外，将两者视为一个因素，对数据进行单因素方差分析（one-way ANOVA），用Tukey检验方法对试验数据进行多重比较，P＜0.05表示处理组间差异有统计学意义，用平均值±标准差表示试验所得数据。

2 结果

2.1 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对幼鱼生长性能的影响

如表2所示：饲料中枯草芽孢杆菌和酵母培养物水平对幼鱼存活率（91.11%～98.89%）的影响差异无统计学意义（P＞0.05）。在每个酵母培养物添加水平下，饲料中枯草芽孢杆菌水平能够显著影响幼鱼SGR，且在0.5%添加水平幼鱼获得最高SGR（P＜0.05）。在每个枯草芽孢杆菌添加水平下，随着饲料中酵母培养物添加量的增加，幼鱼SGR先升高后降低，且也在0.5%添加组中幼鱼SGR较高（P＜0.05）。试验结果也显示，幼鱼SGR在Y1B1和Y1B2组处于较高水平，显著高于对照组（Y0B0）和Y2B2组，而枯草芽孢杆菌和酵母培养物对幼鱼SGR没有表现出显著的交互作用（P＞0.05）。同时，结果显示，FE和PER呈现同SGR相似的变化趋势，且枯草芽孢杆菌和酵母培养物对两者均未表现出显著的交互作用（P＞0.05）。另外，不同试验组间幼鱼摄食率无显著性差异（P＞0.05），而主效应分析显示，枯草芽孢杆菌对幼鱼摄食率具有显著性影响（P＜0.05）。

2.2 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对幼鱼全鱼体组成的影响

饲料中枯草芽孢杆菌和酵母培养物水平对幼鱼全鱼体组成的影响如表3所示。幼鱼在摄食不同饲料8周后，其全鱼粗蛋白、粗脂肪、粗灰分和水分含量在各组之间有一定的波动，但是均无显著性差异（P＞0.05）。同时，枯草芽孢杆菌和酵母培养物对幼鱼体组成各项指标也均未表现出显著的交互作用（P＞0.05）。

表2 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对幼鱼生长性能的影响Table 2 Effects of dietary B.subtilis and yeast culture on growth performance of juveniles

表3 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对幼鱼全鱼体组成的影响Table 3 Effects of dietary B.subtilis and yeast culture on whole fish body composition of juveniles %

2.3 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中氨氮含量的影响

试验结果（表4）显示，随着养殖时间的增加，各试验组养殖水体中氨氮含量均呈显著上升趋势，且Y0B0、Y2B0和Y2B2试验组增幅较大，而Y1B1和Y1B2试验组的增幅较小。与对照组相比，在第6天时，Y1B1和Y1B2试验组氨氮含量分别降低了47.83%和45.65%；在第9天时分别降低了48.53%和46.57%；在第12天时分别降低了32.84%和27.16%。结果也显示，枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中氨氮含量表现出显著的交互作用（P＜0.05）（除第3天外）。

2.4 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中亚硝酸盐含量的影响

如表5所示，在第3天时，各试验组养殖水体亚硝酸盐含量还未表现出显著性差异。而在第6天时，不同试验组间已表现出显著性差异，与对照组相比，Y1B1和Y1B2试验组亚硝酸盐含量分别降低了28.00%和24.00%；在第9天时分别降低了34.15%和29.27%；在第12天时分别降低了28.81%和27.12%。同时，在第6、9、12天时，枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中亚硝酸盐含量均表现出显著的交互作用（P＜0.05）。

2.5 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中化学需氧量的影响

由表6可以看出：与对照组相比，在第3天时，Y1B1和Y1B2试验组化学需氧量分别降低了20.59%和18.72%；在第6天时分别降低了28.99%和25.58%；在第9天时分别降低了33.18%和30.59%；在第12天时分别降低了31.65%和28.57%。结果显示，在水质监控期间，随着试验天数的延长，各试验组中化学需氧量均在升高，且Y1B1和Y1B2试验组与对照组和Y2B2组相比有一定幅度的降低趋势。同时，试验结果表明，在第3、6、9、12天时，枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中化学需氧量均表现出显著的交互作用（P＜0.05）。

3 讨论

3.1 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对幼鱼生长性能有一定的影响

枯草芽孢杆菌是当前水产养殖中应用较为广泛的一种饲料添加剂，具有较强的耐酸、耐高温等特征，在饲料制作及动物肠道内均能保持较高的稳定性，能够产生多种营养物质如维生素、氨基酸、促生长因子等，参与机体的新陈代谢，同时进入肠道后，能够在肠道上部迅速复活与定殖，并产生作用较强的蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，从而提高营养物质的消化吸收，维持和调节鱼体肠道菌群生态平衡，促进动物的生长[9]。本试验结果显示，当饲料中添加0.5%枯草芽孢杆菌时，能够显著提高珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的特定生长率和饲料效率，说明饲料中适宜的枯草芽孢杆菌能够对珍珠龙胆石斑鱼幼鱼的生长性能产生显著的促进作用，这同LIU等[10]在斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）、孙盛明等[11]在团头鲂（Megalobrama amblycephala）、程远等[12]在吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus）、刘晓勇等[13]在杂交鲟（Acipenser baeri♂×Acipenser schrenkii♀）中的研究结果相一致。另外，AI等[14]、仇明等[15]的研究结果还表明，当饲料中枯草芽孢杆菌添加量过高时，鱼体的生长性能会受到一定的抑制；本试验也发现，当饲料中枯草芽孢杆菌添加量为1.0%时，幼鱼的SGR会低于相应的0.5%添加组，同先前的研究结果一致。产生这一结果的原因可能是，鱼体摄食含枯草芽孢杆菌较高的饲料后，导致其肠道内枯草芽孢杆菌数量过高，破坏了肠道内原有的微生物动态平衡，使得肠道内菌群结构失衡，抑制了鱼体内内源酶的活性，降低了其对营养物质的消化吸收能力，从而使得鱼体的生长性能受到抑制。

表4 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中氨氮含量的影响Table 4 Effects of dietary B.subtilis and yeast culture on NH3-N content in farming water mg/L

表5 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中亚硝酸盐含量的影响Table 5 Effects of dietary B.subtilis and yeast culture on NO2－-N content in farming water mg/L

表6 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体化学需氧量的影响Table 6 Effects of dietary B.subtilis and yeast culture on chemical oxygen demand(COD)content in farming water mg/L

本研究显示，在每个枯草芽孢杆菌水平上，当饲料中酵母培养物添加量为0.5%时，幼鱼获得最佳的SGR、FE和PER。这同样也说明，饲料中适宜水平的酵母培养物对鱼体的生长具有一定的促进作用。何远发等[16]研究证实，饲料中添加0.30%～0.50%酵母培养物能够显著提高凡纳滨对虾（Litopenaeusvannamei）的增重率；温俊[17]在牙鲆（Paralichthys olivaceus）研究中也发现，酵母培养物在促进牙鲆的生长和免疫方面具有积极作用。

同时，本试验发现，当饲料中酵母培养物和枯草芽孢杆菌的添加水平为0.5%+0.5%（Y1B1组）或0.5%+1.0%（Y1B2组）时，幼鱼的SGR、FE显著高于对照组，生长性能处于较佳水平，而不同试验组间幼鱼的摄食率并无显著性差异，这也说明饲料利用率的提高是枯草芽孢杆菌和酵母培养物促进珍珠龙胆石斑鱼幼鱼生长的重要方式之一。推测其原因：一方面，可能是因为枯草芽孢杆菌在肠道内定殖，抑制了有害菌繁殖，促进了肠道黏膜（绒毛）的生长，同时，枯草芽孢杆菌通过分泌蛋白酶和淀粉酶增加了肠道的消化吸收功能。另一方面，可能是因为酵母培养物中含有丰富的氨基酸、葡萄糖、维生素、有机酸等营养物质及一些未知的促生长因子，为幼鱼的生长提供了营养物质；另外，酵母培养物中含有的甘露寡糖成分可以促进肠道中有益菌的生长，阻止病菌侵入，从而维持肠道菌群的平衡。同时，本试验添加的是原籍枯草芽孢杆菌，在酵母培养物的基础上，有可能更好地在肠道内定殖和繁殖，这也暗示两者在功能上可能形成相互协同的作用，从而对幼鱼生长产生积极的影响。

3.2 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对幼鱼全鱼体组成有一定的影响

体组成是影响水产动物肉质品质的重要因素，而目前国内外尚无就枯草芽孢杆菌和酵母培养物与水产动物体组成相关性的确切研究定论。本试验结果表明，当饲料中添加不同水平的枯草芽孢杆菌和酵母培养物时，幼鱼全鱼体组成并未受到显著影响。这与先前的部分研究结果相似。沈斌乾等[18]在青鱼（Mylopharyngodon piceus）幼鱼、MERRIFIELD等[19]在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）幼鱼、温俊[17]在牙鲆中的研究结果表明，饲喂枯草芽孢杆菌对全鱼体组成均无显著影响。另外，康学会等[20]在饲料中添加酵母培养物替代鱼粉的研究中发现，异育银鲫（Carassius auratus gibelio）全鱼体组成均未受到显著影响，但6%替代组的全鱼粗蛋白和粗脂肪含量高于对照组、8%和10%替代组。邱燕[21]在草鱼（Ctenopharyngodon idellus）中的研究表明，在饲料中添加酵母培养物并未对全鱼体成分产生显著的影响。然而，也有一些研究报道，枯草芽孢杆菌和酵母培养物会对水产动物体组成产生显著影响。王彦波[22]在罗非鱼的研究中发现，添加芽孢杆菌后鱼体肌肉中粗脂肪含量显著降低，而粗蛋白、粗灰分和水分含量并无显著变化。李高锋[23]研究表明，添加酵母培养物后，团头鲂全鱼、肌肉和肝胰脏中的粗蛋白含量均显著高于对照组。另外，BAGHERI等[24]在用含有芽孢杆菌的饲料喂养虹鳟幼鱼后，发现幼鱼体脂肪含量同菌剂的添加量呈反比，同时鱼体粗蛋白和水分含量也受到一定的影响。这种差异可能是由添加的枯草芽孢杆菌的菌株和剂量不同、酵母培养物的来源不同、养殖种类和养殖规格及环境因子的不同等各种因素造成的。

3.3 枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水质有一定的影响

一系列研究表明，养殖中使用的益生菌能够分泌多种酶、抗生素和抑菌物质，抑制水中病原菌的生长，竞争排斥水体中的有害菌，同时能够分解水中一些低分子有机物，同化氨氮等，使水体中氨基氮、硫化物和亚硝基氮等浓度显著降低，从而使水质得到有效改善[25-26]。在本研究中，通过12 d的水质监测发现，与对照组相比，Y1B1、Y1B2和Y2B1试验组水体中氨氮含量和化学需氧量从第3天开始上升幅度明显降低，同时均在第9天出现最大降幅。另外，从第6天开始，不同试验组水体中亚硝酸盐含量的增幅出现显著差异，其中Y1B1、Y1B2和Y2B1组增幅显著低于对照组。这一结果表明，饲料中添加枯草芽孢杆菌和酵母培养物能够显著改良养殖水体的水质状况，这同先前的众多研究结果基本一致。齐欣等[27]在彭泽鲫的研究中表明，饲料中添加枯草芽孢杆菌后，养殖水体中亚硝酸盐氮、化学需氧量（chemical oxygen demand,COD）和氨氮含量显著降低；胡凡光等[28]选用从健康大菱鲆（Scophthalmus maximus）鱼体肠道分离培养的同源枯草芽孢杆菌制成的饲料添加剂（活菌数2.0×109CFU/g），分别按不同添加量添加到饲料中用于饲喂大菱鲆，结果表明，添加一定比例的枯草芽孢杆菌能够显著降低养殖水体中的NH4+-N、NO2－-N、NO3－-N浓度；仇明等[15]等在斑点叉尾鮰（Ietalurus punetaus）试验中发现，当枯草芽孢杆菌浓度在1×1010～1×1011CFU/m3时，水体中氨氮和亚硝酸盐含量显著低于对照组，能够维持良好的养殖水体生态环境；贺国龙等[29]研究发现，草鱼在摄食含有枯草芽孢杆菌的饲料后，经过10 d的水质监测发现，养殖水体中亚硝酸盐和氨氮含量均有降低趋势，而对COD无显著影响；黄权等[30]在鲤鱼的研究中表明，饲料中添加0.5%的酵母培养物可显著降低养殖水体中的氨氮浓度和活性磷酸盐含量，为鲤鱼的生长提供了良好的水质环境。枯草芽孢杆菌和酵母培养物能够改善水质的原因可能是：在酵母培养物的基础上，枯草芽孢杆菌能够较快地在肠道内定殖和生长，从而能够在幼鱼肠道中消耗硝酸盐和亚硝酸盐，进而从源头上减少了亚硝酸盐的排放；另外，随粪便排到水体中的枯草芽孢杆菌能利用水体中的有机物，减少水体中有机物浓度，降低因有机物发酵分解耗氧和水体中还原性物质因水体pH值变化而发生氧化反应的耗氧，即降低了水体中的COD，同时，能够通过自身的自养亚硝化和自养反硝化的脱氮作用，进而降低水体中亚硝酸盐氮和氨氮含量[31]。

同时，本研究结果表明，枯草芽孢杆菌和酵母培养物对养殖水体中亚硝酸盐、氨氮和COD均表现出显著的交互作用，这也暗示两者在功能上可能具有相辅相成的作用，这也同上述幼鱼的生长性能结果相一致。但是，研究也发现，当两者添加量均为1.0%时，养殖水质并不能得到进一步改善，反而出现恶化的趋势，这可能是因为，幼鱼摄食两者含量较高的饲料后，鱼体肠道内微生物平衡被打破，不能完全消化吸收摄食的营养物质，导致过剩的营养物质排到水体中，从而使得水体的富营养化程度升高，进而导致水体进一步恶化。

4 结论

本试验结果表明，当饲料中酵母培养物和枯草芽孢杆菌添加水平为0.5%+0.5%（4.03×106CFU/g）和0.5%+1.0%（7.95×106CFU/g）时，珍珠龙胆石斑鱼幼鱼获得最佳的生长性能，且全鱼含有较高的粗蛋白，同时，养殖水质也得到明显改善。