李鹏，谭璐，李林云，薛银钢，毛大庆

1. 天津大学环境科学与工程学院，天津 300350 2. 南开大学医学院，天津 300071 3. 南开大学环境科学与工程学院，教育部环境污染过程与基准重点实验室，天津 300350 4. 常州市环境监测中心，江苏省环境保护水环境生物监测重点实验室，常州 213001

随着抗生素在医疗行业以及畜牧业的滥用，耐药细菌的全球性传播已经成为威胁全球公共安全的重要问题之一。细菌的耐药性一般由其携带的耐药基因(ARGs)编码产生，例如，携带β内酰胺耐药基因NDM-1(blaNDM-1)的细菌能够抵御8种以上的抗生素，被称为“超级细菌”，而感染此类病菌的人将面临无药可治的状况[1]。携带blaNDM-1的细菌首次于2008年在印度新德里被发现[2]，随后迅速传入其他国家，成为了全球关注的焦点，因此，研究人群的跨国迁徙对于耐药细菌的全球传播具有重要意义。随着民用飞机安全性、舒适性和环保性的不断提高，民航飞机现已成为国内外旅行的主要交通工具。据统计，每年全球飞机载客超过3百万人次，在飞行过程中，人群处于低压缺氧、低湿度、高人群密度的机舱内，为病毒及病菌的传播提供了良好的条件[3-4]。由病毒引起的感染性疾病(如SARS和H1N1等)在飞行过程中的传播扩散已经被频繁报道[5-8]，然而，耐药基因及耐药细菌在机舱环境内的赋存及传播还未有研究。

大气环境中耐药基因的研究相对较少，已有报道显示，大气中耐药基因的研究主要包括动物饲养场[9-11]、污水处理厂[12]、医院[13]、农贸市场[14-15]及室外[16]等。Li等[17]对污水处理厂中空气研究发现，sul2和intI1两种耐药基因被检出。陶墨奎[18]对医院婴儿室空气中的1 333株葡萄球菌(Staphylococcus)研究发现，在所检测的菌株中致病菌葡萄球菌所占比例为68.9%，所有菌株对常见的药物如红霉素(erythromycin)、四环素(tetracycline)和林可霉素(lincomycin)等都有较高的耐药性。Xie等[19]在中国武汉的工业-城市-农村带中发现，ermB、tetW和qnrS等抗性基因均都有检出，且其细菌总数随季节性变化。Zhou等[20]在中国三大城市(北京、天津和石家庄)城市的空气尘埃样品中检出20种具有磺胺、四环素、大环内酯、β-内酰胺和氨基糖苷或喹诺酮类抗生素耐药性的抗性基因；同时分离鉴定出80株耐药细菌，其中有12株条件致病菌。

本研究采集了一架跨国航线客机机舱内高效空气过滤器(high efficiency particulate air filter, HEPA)上截留的颗粒物，定量检测了其中多种耐药基因，同时对截留的细菌进行了分离、培养和鉴定，并且对这些细菌的8种抗生素耐药表型进行了检测，以期揭示飞行过程中机舱空气介导的耐药基因传播的污染特征。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

样品取于空客A320民用客机上第3次更换后的圆筒状HEPA，圆筒高约28 cm，直径为34 cm，HEPA的更换周期为3个月。使用无菌剪刀将HEPA圆筒外壳减掉，将内部过滤棉转移至无菌密封袋中-20 ℃保存。

1.2 实验方法

1.2.1 HEPA颗粒物DNA提取

使用无菌剪刀将过滤棉剪裁成11 cm×23 cm的小块，放入含有150 mL PBS溶液的锥形瓶中，220 r·min-1、37 ℃震荡3 h，用0.22 μm滤膜过滤，再次加入PBS溶液，震荡并过滤，重复上述过程直至溶液澄清。然后使用Water DNA Kit(Omega Bio-Tek, D5525-01)试剂盒按照说明书要求提取滤膜DNA。DNA提取过程中所使用的试剂及耗材全部经过灭菌处理。

1.2.2 耐药基因定量分析

采用荧光实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR)的方法对机舱HEPA样本中31种耐药基因(包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类、磺胺类、大环内脂类及喹诺酮类耐药基因)以及Ⅰ类整合子特异基因(intI1)进行定量检测，同时对16S rRNA基因进行定量检测[21-23]。耐药基因的相对含量定义为耐药基因拷贝数与16S rRNA拷贝数的比值(ARGs copies/16S rRNA gene copies)。

1.2.3 细菌的分离与鉴定

将样品剪碎溶于2 mL灭菌的1×PBS缓冲液中，涡旋振荡30 min后，将溶液以10倍的梯度稀释为2×、3×、4×和5×样品缓冲溶液，取100 μL溶解后的样品涂于LB培养基，每个样品做2个平行，所有平板置于(35±2) ℃恒温培养箱中培养24 h。培养后，观察记录菌落的形态特征，在LB平板上划线纯化细菌，置于(35±2) ℃恒温培养箱中培养24 h。若为单一菌落，则用接种环挑取单个菌落置于5 mL培养基试管中，于37 ℃恒温摇床培养箱中进行过夜培养。

将培养好的菌液进行细菌基因组DNA提取，取2 mL菌液置于离心管中，利用天根牌基因组试剂盒(TIANGEN)进行细菌DNA获取。取5 μL PCR产物做琼脂糖凝胶电泳实验，然后将PCR产物送往北京奥科生物技术有限责任公司做序列测序。在NCBI网站上对测序结果进行序列比对，最终得到细菌菌属鉴定结果。

1.2.4 细菌耐药性检测

将待测菌株接种于LB培养基中37 ℃过夜培养，使用生理盐水(0.85% NaCl)稀释至OD600=0.5；用二倍稀释法分别配制含有环丙沙星(ciprofloxacin)、四环素(tetracycline)、磺胺甲恶唑(sulfamethoxazole)、氨苄西林(ampicillin)、氯霉素(chloramphenicol)、链霉素(streptomycin)、庆大霉素(gentamycin)和亚胺培南(imipenem)的MHB培养基，质量浓度依次为0.5, 1.0, 2.0, …, 1 024 μg·mL-1，将稀释好的菌液接种至含有抗生素的培养基中，37 ℃培养过夜；平板置于暗色、无反光物体表面上判断实验终点，以抑制细菌生长的最低抗生素质量浓度为待测细菌的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)值。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)的标准对于细菌的耐药性进行判定[24]。

2 结果(Results)

2.1 耐药基因及Ⅰ类整合子定量分析

检测结果表明，在选取的31种耐药基因类型中，有5种耐药基因类型(qnrA、blaVIM-1、tetM、tetO和ereB)的含量低于检出限，有26种耐药基因及intI1基因被检出，包括3种磺胺类耐药基因(sul1、sul2和sul3)，4种四环素类耐药基因(tetA、tetC、tetQ和tetW)，6种氨基糖苷类耐药基因(aac(6’)-Ⅱ、aacC2、aacC3、aacC4、strA和strB)，10种β-内酰胺类耐药基因(blaAmpC、blaCMY-2、blaDHA-1、blaGES-1、blaOXA-1、blaOXA-2、blaOXA-10、blaOXA-30、blaSHV-1和blaTEM-1)，2种大环内酯类耐药基因(ermB、ermC)和1种喹诺酮类耐药基因(qnrS)。耐药基因的总体检出频率为83.9%，其相对含量如图1所示。由图可知，Ⅰ类整合子基因的相对含量最高，为3.94×10-1。检测的10种β-内酰胺类耐药基因的相对含量在1.51×10-5～1.26×10-2之间，其中含量最高的为blaCMY-2，含量最低的为blaGES-1；检测的6种氨基糖苷类耐药基因的相对含量在1.59×10-6～1.61×10-2之间，其中aac(6’)-Ⅱ的含量最低，为1.59×10-6，aacC2的含量最高，为1.61×10-2；检测的4种四环素类耐药基因的相对含量在4.87×10-5～1.29×10-2之间，其中tetC的含量最低，tetW和tetQ含量相对较高；检测的3种磺胺类耐药基因的相对含量都相对较高，sul2含量最高，为4.81×10-2；2种大环内酯类耐药基因ermB和ermC的相对含量大致相同，分别为2.44×10-4和3.26×10-4；喹诺酮类耐药基因qnrS的相对含量为3.92×10-4。

2.2 机舱气溶胶细菌的分类与鉴定

从飞机空气过滤网中总共分离鉴定出64株细菌，根据其16S rRNA片段序列在NCBI上的比对结果鉴定其种属，分类结果如图2所示。其中属于厚壁菌门(Firmicutes)的细菌共31株，占比为48%，属于变形菌门(Proteobacteria)的细菌有16株，占比为25%。放线菌门(Actinobacteria)共有10株，占比为16%，同时还分离出1株拟杆菌门(Bacteroidetes)的细菌。在属分类水平上，包括芽孢杆菌属(Bacillus)27株，肠杆菌(Enterobacter)15株，微球菌(Micrococcus)10株，土芽孢杆菌属(Geobacillus)、金黄杆菌(Chryseobacterium)、土壤短波单胞菌(Brevundimonasterrae)、类芽孢杆菌(Paenibacillus)、短杆菌(Brevibacillus)和葡萄球菌(Staphylococcus)各1株。

图1 26种耐药基因及Ⅰ类整合子的相对含量Fig. 1 Relative abundance of 26 resistance genes and intI1

图2 细菌在门和属水平上的分类Fig. 2 Classification of bacteria at phylum and genus level

2.3 机舱气溶胶细菌耐药性检测

对分离出的64株细菌的耐药表型检测结果如表1所示。从能够耐受的抗生素的质量分数来看，对于磺胺甲恶唑的耐受性普遍较高，其中MIC>512 μg·mL-1的菌株有50株。对于四环素、氯霉素和链霉素的耐受性普遍较低，其MIC基本在16 μg·mL-1以下。根据CLSI的标准对于细菌的耐药性进行判定，不同抗生素的耐药菌株数如图3所示，发现具有磺胺甲恶唑耐受性的细菌为50株(78.1%)，具有庆大霉素耐受性的细菌为41株(64.1%)，具有亚胺培南耐受性的细菌为24株(37.5%)，具有氯霉素耐受性的细菌为4株(6.3%)，具有四环素耐受性的细菌为4株(6.3%)，所有细菌对于环丙沙星均无耐受性。细菌多重耐药特征如图4所示，对分离出的细菌的多重耐药特征进行分析发现，有3株细菌具有五重抗性，23株细菌具有四重抗性，11株细菌具有三重抗性，18株细菌具有两重抗性。

图3 不同抗生素耐药菌株数目注：SMX、GEN、IMP、CHL、TET和CIP表示磺胺甲恶唑、 庆大霉素、亚胺培南、氯霉素、四环素和环丙沙星。Fig. 3 Number of strains resistant to different antibiotics Note: SMX, GEN, IMP, CHL, TET and CIP stand for sulfamethoxazole, gentamycin, imipenem, chloramphenicol, tetracycline and ciprofloxacin.

图4 细菌多重耐药性特征Fig. 4 Multidrug resistance characteristics of bacteria

表1 8种抗生素对分离菌株的最低抑菌浓度(MIC)Table 1 Minimum inhibitory concentration (MIC) of 8 antibiotics on bacteria

注：菌株种的确定是由NCBI比对结果所得，相似度超过97%。MIC单位为μg·mL-1。

Note: The species of the strain was obtained through NCBI comparison, and the similarity was over 97%. The unit of MIC is μg·mL-1.

3 讨论(Discussion)

目前，对于空气中耐药基因及耐药菌的研究主要涉及动物饲养场、污水处理厂、医院、农贸市场及室外等。对一些相对封闭环境中的空气研究较少。本文通过对机舱空气过滤网HEPA上细菌的耐药性进行分析，来揭示机舱空气环境中耐药基因的传播风险。Ⅰ类整合子在耐药基因的水平转移过程中起重要作用，样品中intI1的相对含量为3.94×10-1，比美国科罗拉多州的猪场高了将近300倍，比奶牛场高了将近100倍[25]。高浓度的Ⅰ类整合子暗示着机舱环境内的耐药基因有着向其他细菌进行水平转移的风险。HEPA中分离出的细菌有很多都是条件致病菌，比如阴沟肠杆菌和蜡样芽胞杆菌等，而Zhou等[20]也在中国北方三大城市样品中分离得到这2种条件致病菌。此外，本研究发现有78.1%的细菌对磺胺甲恶唑耐药，这比金明兰等[26]从养殖场空气中分离出的360株大肠杆菌对磺胺甲恶唑的耐药比例(73.6%)还高。几乎所有的肠杆菌属都对磺胺甲恶唑、庆大霉素、氨苄西林和亚胺培南具有耐受性；10株微球菌中9株都对庆大霉素和亚胺培南敏感；在所有细菌中，只有4株芽孢杆菌对四环素具有耐药性；81%的芽孢杆菌对亚胺培南敏感。以上结果表明，机舱环境是耐药基因传播的高风险环境，对于此类环境介导的耐药基因传播特征需要更多的关注。