周 可，魏冬苓，张峰峰，赵 琼，赵玉洁，谢凤行

（天津市农业生物技术研究中心，天津300384）

番茄早疫病是由茄链格孢菌（Alternaria solani）侵染所致的一种世界性植物真菌病害，茄链格孢菌能侵染番茄的叶、茎和果，可危害各个生长时期的番茄植株，严重时会给菜农造成80%的经济损失[1-2].黄瓜枯萎病是保护地黄瓜栽培常见的一种土传性真菌病害，其病原菌为黄瓜专化型尖孢镰刀菌（Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.Cucumerinum owen），在我国各地均有发生，发病率一般为l5%～25%，严重时达60%～70%，有的甚至全田枯萎死亡，因此该病害被认为是黄瓜病害中的癌症[3].黄瓜灰霉病由灰葡萄菌（Botrytis cinerea）引发，是温室黄瓜高发病害之一，轻者减产20%～30%，重者减产50%以上[4].生产上对上述3 种病害的防治主要依靠化学药剂，但是化学农药毒性较高，结构稳定，难以降解，会造成环境和食品污染，严重威胁人们的身体健康.长期使用化学药剂，也易使病菌产生抗药性，降低药剂的防治效果.生物防治则具有对人畜安全、不污染环境、不易使病菌产生抗药性等优点，因此植物病害的生物防治成为研究热点[5].

芽胞杆菌具有较广的抗菌谱，对多种病原真菌和细菌均有强烈的抑制作用，生防利用价值高[6].解淀粉芽胞杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）是芽胞杆菌中的一种，能够产生抗真菌蛋白、表面活性素、伊枯草菌素、几丁质酶等物质[7-9].解淀粉芽胞杆菌具有线状或环状结构，分子质量小，热稳定性好，含有D-氨基酸，能耐受蛋白酶的水解作用，具有无毒、无害、无残留、抑菌时效长等优点[10]，对许多危害严重的病原菌都有很强的抑菌活性[11-15]，如对小麦全蚀病[16]、蔬菜灰霉病[17]及水稻纹枯病[18]等的病原菌均有较好的生物防治作用.有研究表明，解淀粉芽胞杆菌XZ-1 的发酵液可以抑制甘薯黑斑病病原菌孢子的萌发，对菌丝没有明显的致膨大和致畸作用[19]；解淀粉芽胞杆菌SF1103 则可使黄瓜枯萎病病原菌的菌丝和孢子形态发生严重畸形并停止发育[20].

本研究拟以本课题组自主选育的解淀粉芽胞杆菌菌株HN 为生防菌，采用体外抑菌实验研究该菌株对番茄早疫病、黄瓜枯萎病、黄瓜灰霉病3 种病原真菌的抑制效果，并初步探讨解淀粉芽胞杆菌对病原真菌的抑菌机理，为解淀粉芽胞杆菌HN 作为生防菌在番茄和黄瓜上的应用提供理论依据.

1 材料和方法

1.1 菌种

拮抗菌：解淀粉芽胞杆菌菌株HN 为本课题组分离保存.

病原菌：A，番茄早疫病病原菌（Alternaria solani）；B，黄瓜枯萎病病原菌（Fusarium oxysporum（Schl.）f.sp.cucumerinum owen）；C，黄瓜灰霉病病原菌（Botrytis cinerea）.3 者均来源于天津市植物保护研究所.

1.2 培养基

PDA 培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，水1 L，琼脂15～18 g.

细菌培养基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，琼脂15～18 g.

察氏培养基： NaNO32 g，K2HPO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，KCl 0.5 g，FeSO40.01 g，蔗糖30 g，水1 L.

1.3 病原菌最适培养温度的筛选

分别在番茄早疫病、黄瓜灰霉病、黄瓜枯萎病3种病原菌的菌落边缘用打孔器打取直径为6 mm 的菌饼，将菌饼接种于PDA 平板中央.接种后分别置于25 ℃和30 ℃恒温培养箱中培养，每个处理重复3 次，每天用十字交叉法测量菌落直径，待长满平板时结束实验.

1.4 HN对病原真菌的抑制作用

1.4.1 对峙培养

将HN 以10%的体积比接种于细菌液体培养基中，150 r/min、36 ℃下振荡培养24 h，汲取100 μL 菌液在细菌固体平板上涂布，36 ℃下培养24 h，用直径为6 mm 的打孔器打取菌饼.将病原菌菌饼接种在PDA 固体培养基中央，20 mm 外四周等距接入解淀粉芽胞杆菌菌饼，以不接细菌菌饼的处理为对照（CK），每个处理重复3 次，置于25 ℃下培养.该实验做2 种不同的处理：一种是拮抗菌与病原菌同时接于培养基中培养；另一种是先接拮抗菌于培养基中，培养2 d后再接病原菌.每天采用十字交叉法测量菌落直径（d）和拮抗带宽（Antagonistic bandwidth），待对照长满平板时结束实验，计算抑菌率（Inhibition rate）.

拮抗带宽=2 个接菌点连线上的无菌区宽度

抑菌率（%）=（d对照-d处理）/d对照×100

1.4.2 牛津杯法

孢子悬液的制备： 将病原菌接种到察氏培养基上，25 ℃下振荡培养7 d，用无菌纱布过滤，滤液即为孢子悬液，孢子浓度＞104mL-1.

无菌滤液的制备：将解淀粉芽胞杆菌菌株HN 接种到液体细菌培养基中，36 ℃、150 r/min 条件下培养48 h.4 ℃、8 000 r/min 条件下离心20 min，上清液用0.22 μm 的滤膜过滤即为无菌滤液.

在PDA 平板中央分别接种番茄早疫病、黄瓜灰霉病、黄瓜枯萎病的病原菌，在离菌饼对称的3 点分别放置1 个牛津杯，牛津杯中分别加入200 μL 无菌滤液、发酵菌液、培养基（灭菌）.放入25 ℃培养箱中培养，以确定抑菌活性成分存在的部位.

1.4.3 HN 无菌滤液的添加量对病原菌菌丝生长的影响

采用平板稀释法，以1/10、1/20、1/40 和1/80 的体积比将无菌滤液加入到40～50 ℃的PDA 培养基中，混匀后倒平板，以不加滤液的平板为对照.凝固后分别将直径为6 mm 的3 种病原菌菌饼接种到CK、无菌滤液体积比分别为1/10、1/20、1/40、1/80 的PDA 平板上，每个处理重复3 次，放入25 ℃恒温培养箱中培养，6 d后测量菌落直径.

1.5 HN对病原菌的抑菌机理研究

1.5.1 HN对菌丝生长的影响

在凹形载玻片中滴一滴液体PDA 培养基，在培养基两端分别接种病原菌和解淀粉芽胞杆菌HN，CK只接病原菌，盖上盖玻片，25 ℃下培养2 d 后，在显微镜下观察菌丝生长状况.

1.5.2 HN对真菌孢子萌发的影响

在凹形载玻片上滴加10 μL 无菌蔗糖溶液（质量分数为0.1%），分别加入10、20、30 μL 的解淀粉芽胞杆菌HN 无菌滤液，再加入10 μL 的真菌孢子液，使无菌滤液的体积比分别为1/3、1/2、3/5.其中，黄瓜枯萎病病原菌孢子液稀释10 倍后添加，番茄早疫、黄瓜灰霉病病原菌直接添加孢子原液.以不加无菌滤液的处理组为对照，每个处理重复3 次.处理后放入加有湿滤纸的培养皿中，盖好后放入25 ℃培养箱中，10 h后检测孢子萌发率.

2 结果与分析

2.1 病原菌培养最佳温度的筛选

3 种病原菌在25 ℃和30 ℃下的生长情况如图1所示.由图1 可以看出，3 种病原菌均是在25 ℃条件下生长较快，在30 ℃下生长较慢.其中，黄瓜灰霉病病原菌在25 ℃条件下，培养4 d 后即长满平板，而在30 ℃时几乎停止生长；黄瓜枯萎病病原菌25 ℃条件下的生长速率显著高于30 ℃下的速率，6 d 后长满平板；番茄早疫病病原菌培养至6 d 后，25 ℃和30 ℃下的菌落直径分别为77.5 mm 和60.0 mm.这些结果说明，25 ℃条件利于上述3 种病原菌的生长，在后期实验中，病原菌培养温度应选择25 ℃.

图1 不同温度下病原菌的生长Fig.1 Fungus pathogens growth under different temperatures

2.2 HN对真菌的抑制作用

2.2.1 对峙培养的抑菌效果

HN 分别与番茄早疫、黄瓜灰霉、黄瓜枯萎3 种病原菌进行对峙培养，拮抗菌与病原菌同时接种的微生物生长情况如图2（a）所示，具体抑菌效果如表1 所示；先接种拮抗菌，培养2 d 后再接病原菌的微生物生长情况如图2（b）所示，具体抑菌效果如表2 所示.

图2 HN 与3 种病原菌对峙培养的结果Fig.2 Results of confrontation cultivation of HN and the three kinds of fungus pathogens

表1 HN 与病原菌同时接种的抑菌情况Tab.1 Growth inhibition on fungus pathogens by HN under simultaneous inoculation

表2 先接HN 后接病原菌的抑菌情况Tab.2 Growth inhibition on fungus pathogens by HN under inoculation followed by fungus pathogens

由图2 可以看出，无论是解淀粉芽胞杆菌HN 与3 种病原菌同时接种还是先接种HN 后接种病原菌，对峙培养后，在病原菌与拮抗菌之间均形成了明显的抑菌带，拮抗菌HN 周围产生明显的抑菌圈，表明HN对3 种病原菌均有抑制作用.比较2 种接种方式可以看出，先接种HN 后接病原菌其抑菌圈明显大于同时接种的抑菌圈.从表1 可以看出，同时接种时，HN对3 种病原菌的抑菌率接近，分别为54%、56%和55%，其中对番茄早疫病病原菌的拮抗带宽最大，为2.70 mm，对黄瓜枯萎病病原菌的拮抗带宽最小，仅为0.50 mm.从表2 可以看出，先接种HN，培养2 d 后再接种病原菌时，HN对番茄早疫、黄瓜枯萎、黄瓜灰霉3 种病原菌的抑菌率分别为77%、67%和81%，拮抗带宽分别为7.80、3.70 和8.90 mm，显著高于同时接种的效果.这可能跟拮抗菌占据了有利的营养空间以及在生长过程中分泌的抗菌活性物质有关，这也说明HN“防”效果要好于“治”.

2.2.2 牛津杯法的抑菌效果

通过牛津杯法检测HN 的抑菌活性物质来源于菌体细胞内还是细胞外，结果如图3 所示.由图3 可以看出，解淀粉芽胞杆菌HN 的无菌滤液和发酵菌液对病原菌均有一定的抑制作用，在牛津杯周围形成明显的抑菌圈，而且无菌滤液的抑菌效果与发酵菌液的抑菌效果相当，说明抑菌活性物质为一种胞外产物.

图3 HN 不同成分对3 种病原菌的抑菌效果Fig.3 Inhibition effect of different compositions of HN on the three kinds of fungus pathogens

2.2.3 HN 无菌滤液添加量对病原菌菌丝生长的影响

培养基中加入不同量的HN 无菌滤液后，3 种病原菌菌丝的生长情况如图4 所示.

图4 无菌滤液添加量对病原菌菌丝生长的影响Fig.4 Effect of dosage of aseptic filtrate on the growth of mycelium

由图4 可以看出，不同添加量的HN 无菌滤液作用下，3 种病原菌菌丝的生长均受到显著抑制，其效果随着添加量的增加而增强，在1/10、1/20、1/40 的体积比下其抑菌效果比较接近，抑菌率均达到80%以上，在1/80 的体积比下抑制作用略有降低，但抑菌率也超过了75%.HN 无菌滤液对不同的病原菌抑制能力有所不同，对黄瓜灰霉病病原菌的抑制效果最好，在无菌滤液的体积比为1/10 和1/20 培养基中，黄瓜灰霉病病原菌基本不生长，连接种的菌丝也慢慢消失，抑制率达到100%.HN 无菌滤液对3 种病原菌的抑菌效果优于HN 菌体细胞，这可能是因为无菌滤液中的抑菌活性物质存在于培养基中，接种病原菌后立即就能发挥作用，而对峙培养抑菌活性物质来源于拮抗菌生长的代谢产物，有一定的时滞.这也解释了先接拮抗菌后接病原菌的抑菌效果为何优于同时接种.

2.3 HN 的抑菌机理

2.3.1 HN 菌体对病原菌菌丝生长的影响

HN 菌体作用下，3 种病原菌菌丝的生长情况如图5 所示.

图5 HN 菌体对菌丝生长的影响（40×）Fig.5 Effect of HN on the growth of mycelium（40×）

由图5 可以看出，3 种病原菌正常培养时，菌丝长而直，粗细均匀.而HN 与病原菌对峙培养2 d 后，3 种病原菌菌丝的生长均发生明显变化：有的菌丝端部和中部膨大成球状，菌丝直径变得较肿大，整个菌丝变为念珠状，内含物清晰可见，最后消失变为空胞；有的菌丝分枝增多，菌丝出现畸形、弯曲；有的菌丝发生断裂.

2.3.2 HN 无菌滤液对真菌孢子萌发的影响

HN 无菌滤液作用下，3 种病原菌孢子的萌发情况如图6 所示，萌发率如表3 所示.

图6 HN 无菌滤液对孢子萌发的抑制作用（40×）Fig.6 Inhibitory effect of the aseptic filtrate of HN on spore germination（40×）

表3 病原菌孢子在不同浓度HN 无菌滤液处理下的萌发率Tab.3 Spore germination rates of fungus pathogens under the aseptic filtrate of HN with different concentrations %

由图6 可以看出，经HN 无菌滤液处理后，病原菌的分生孢子或是不能正常萌发，或是萌发后孢子较正常萌发的孢子芽管细小而短，继续培养也无法正常生长.这说明无菌滤液中的抗菌物质对病原菌孢子有杀灭效果.由表3 可以看出，不同用量的无菌滤液处理下，番茄早疫病病原菌的孢子基本不萌发；黄瓜枯萎病病原菌的孢子在1/3 和1/2 无菌滤液处理下萌发率比较接近，而在3/5 无菌滤液处理下萌发率迅速降为35%；黄瓜灰霉病病原菌的孢子在不同用量无菌滤液处理下的萌发率均低于50%，在3/5 滤液处理下萌发率仅为19%.这些结果说明，HN对不同病原菌的有效抑菌浓度不同，实际应用时应根据不同的病原菌选择合适用量以达到最佳防治效果.

3 讨论与结论

本研究以解淀粉芽胞杆菌菌株HN 为生防菌，测试其对于番茄早疫病、黄瓜枯萎病和黄瓜灰霉病3 种病原菌的抑菌效果.实验结果表明，HN对于3 种病原菌均有良好的抑制作用.其中，无菌滤液的体积比为1/80 时对3 种病原菌的抑制率均超过75%，体积比为1/10、1/20 时无菌滤液对3 种病原菌的抑制率均超过80%，抑菌效果优于解淀粉芽胞杆菌MH71 和fqhm-13（MH71 体积比为1/80 的发酵滤液对黄瓜灰霉病的抑制率只有45.39%，fqhm-13 发酵原液对黄瓜灰霉病的抑制率为78.1%[21]）.HN 能显著抑制病原菌的孢子萌发，无菌滤液体积比为3/5 处理下番茄早疫病、黄瓜枯萎病和黄瓜灰霉病病原菌的孢子萌发率分别只有1%、35%和19%.综上，HN 具有广谱抑菌活性且抑菌效果突出，具有较大的开发潜力.

对峙培养发现，3 种病原菌菌丝均出现膨大、畸形、断裂、细胞内容物溢出呈空腔等现象，孢子芽管出现畸变、停止发育现象，推测解淀粉芽胞杆菌HN 通过产生抗菌代谢产物抑制病原菌菌丝和孢子的萌发，从而达到抑菌效果，这与李晓红等[21]、罗晶等[16]、陈欣怡[22]、王玉双等[23]的研究结果一致.以往研究表明，解淀粉芽胞杆菌的抗菌活性物质分为2 类：一类为细菌素、表面活性素等脂肽类物质；另一类为几丁质酶、葡聚糖酶等酶类物质[24].至于HN 的抗菌活性物质具体是什么、能否诱导植物产生抗性从而阻止病原菌侵入还有待于进一步研究.