王爱丽，商书波，孙梦瑶，王芳

德州学院山东省功能材料与配位化学高校重点实验室，德州 253023

邻苯二甲酸酯(PAEs)，又名酞酸酯，是一种典型的内分泌干扰物，部分PAEs已被美国环保署(EPA)和我国列为优先监测污染物[1]。PAEs作为塑料增塑剂，被广泛应用在地膜中，由于PAEs并未聚合到塑料的基质中，因此农田土壤中有PAEs检出，其含量已达到几十mg·kg-1[1-3]。国内外学者对PAEs的削减研究主要集中在植物修复[4-6]、微生物降解[7-9]以及植物微生物联合修复[10]等方面。

近年来，随着蔬菜消费需求的不断增加，地膜覆盖技术已广泛应用到蔬菜的种植中[11]。研究发现，被PAEs污染的土壤中种植蔬菜后，许多蔬菜如冬瓜、花椰菜、辣椒、菠菜、莴苣、花生和萝卜等[12-14]可吸收并累积PAEs，且蔬菜中累积的PAEs浓度与土壤中PAEs的污染浓度成正比。冯艳红等[15]在江苏省设施菜地采集的50个蔬菜样品中PAEs含量为38.31～241.87 μg·kg-1，检出率为100%。陈佳祎等[2]采集北京市昌平区、延庆区和顺义区的8个典型设施蔬菜基地的16份蔬菜样品，测定出PAEs浓度为0.15～6.94 mg·kg-1。研究表明，长期食用被PAEs污染的蔬菜会干扰血液中激素的正常水平，如果超过美国EPA规定的1.2 mg·d-1的摄入量标准(体重60 kg)[16]，会存在一定的安全风险。

番茄是我国栽培最为普遍的果菜之一，在蔬菜供应中占有重要的地位。关于番茄种植过程中番茄对PAEs吸收累积方面的报道较少，为了明确番茄种植过程中番茄对土壤中PAEs的吸收累积及PAEs在土壤中的削减特征，本研究选择2种污染程度最广泛的PAEs：邻苯二甲酸正丁酯(DBP)和邻苯二甲酸异辛酯(DEHP)作为研究对象，采用盆栽实验研究番茄种植过程中番茄植株及果实对土壤中DBP和DEHP的吸收累积特征及土壤中DBP和DEHP的削减特征，并计算生物富集因子，以期发现PAEs在番茄中的累积规律以及在土壤中的削减规律，为PAEs污染土壤的农作物栽培以及植物修复提供理论依据，为消费者的膳食暴露风险评估提供实验数据。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 供试材料

(1)土壤

土壤采自德州市郊区农田，风干后过2 mm筛，理化性质：pH值为7.5，有机质为14.5 g·kg-1，碱解氮为70.6 mg·kg-1，速效磷为90.7 mg·kg-1，速效钾为424.5 mg·kg-1。

(2)番茄苗

无菌番茄苗：将番茄种子先用蒸馏水浸泡，再用75%酒精浸泡，5%次氯酸钠消毒，最后用蒸馏水清洗多次，在灭菌的MS固体培养基中培养。

未灭菌番茄苗：番茄种子用水浸泡后播种在泥炭土中。

1.2 仪器与试剂

仪器：HR40-IIA2超净工作台(中国Haier公司)；TG16G型台式高速离心机(江苏省盐城市凯特实验仪器有限公司)；6890N/5975C气质联用仪(美国Agilent公司)。

试剂：DBP、DEHP，优级纯，购于美国Sigma Aldrich公司。

1.3 试验设计

根据番茄对DBP和DEHP的耐受程度以及现场调查蔬菜大棚土壤PAEs的污染水平，对盆栽实验中DBP和DEHP的添加量设计了低(10 mg·kg-1)、中(20 mg·kg-1)和高(50 mg·kg-1)3个污染水平。为了研究番茄对土壤中PAEs的吸收累积特征及微生物对番茄吸收累积PAEs的影响，盆栽实验采用4种处理方式：①灭菌土壤；②灭菌土壤+无菌番茄苗；③未灭菌土壤；④未灭菌土壤+未灭菌番茄苗。每种处理方式设3个重复，共36盆。

1.4 盆栽实验

土壤粒径的测定参考Chaudhari等[17]的方法，测定出砂粒、粉粒和粘粒的质量分数分别为49.4%、37.1%和13.5%。

污染土壤的制备：用500 mL浓度为2 000 mg·L-1的DBP和DEHP甲醇溶液先染毒一部分土壤(约10 kg，占实验所用土量的10%)，待甲醇挥发完全后，将此染毒土壤与其余未染毒部分(约90 kg)混合，为确保混合均匀，将土壤再次过2 mm筛，得到染毒浓度为10 mg·kg-1的污染土壤。浓度为20 mg·kg-1和50 mg·kg-1污染土壤按照上述方法制备。

上述3个浓度的污染土壤用蒸馏水调节至田间持水量，作为盆栽实验用土。稳定7 d后测得DBP和DEHP的初始浓度见表1。取其中一部分土壤采用高压蒸汽灭菌法(121 ℃，20 min×3次)进行灭菌处理，作为灭菌土壤。

盆栽实验于2016年5月上旬至11月下旬在德州学院玻璃温室内进行，实验用瓷盆底部内径为20.0 cm、上部内径为27.0 cm、高为17.0 cm，每盆定植番茄苗一株。种植期间进行田间常规管理，保证自然光照和充足水分，11月24日收集供试番茄根、地上部分(茎、叶)和果实样品。采样时，先用剪刀将番茄茎叶从土表处剪断，然后将盆倒扣，采用抖根法分别获得番茄根和根际土。

1.5 样品预处理及PAEs测定

番茄植株预处理：取20.0 g番茄植株(湿重)于高速组织捣碎机中打碎，称取2.0 g打碎样品，放入组织研磨器，加入5 mL CH2Cl2，研磨5 min。将番茄植株匀浆移至离心管中，4 500 r·min-1离心5 min，先去掉上层水相，然后用胶头滴管吸取CH2Cl2层到K-D浓缩器中，在N2吹脱下浓缩至1 mL。

土壤样品(番茄栽培根际土壤和无番茄栽培土壤)预处理：取1 g土壤于10 mL离心管中，加入3 mL CH2Cl2，超声萃取15 min，4 000 r·min-1离心5 min，倾出上清液于10 mL K-D浓缩管中，重复3次，合并有机相，在N2吹脱下浓缩至1 mL。

PAEs含量测定：采用Agilent 6890N/5975C气质联用仪(石英毛细管柱HP-5MS)，升温程序为：初始温度100 ℃，保持1 min，20 ℃·min-1升至280 ℃，保持3 min。载气He，流量1.0 mL·min-1，不分流进样，进样1 μL，进样口和检测器温度250 ℃，EI源70 eV[18]。

1.6 微生物测定

细菌和真菌的测定采用稀释平板法，具体步骤参考范秀荣的微生物学实验[19]。细菌培养2 d，真菌培养5 d后计数，根据稀释倍数和加入的菌液量计算出菌落个数，单位：CFU·g-1土(干重)。

可降解菌的测定步骤参考Toyama的方法[20]，无机盐培养基中包含15 mg·L-1的DBP和DEHP，以DBP和DEHP作为唯一碳源，于30 ℃培养箱中培养5 d后计数，根据稀释倍数和加入的菌液量计算出菌落个数，单位为CFU·g-1土(干重)。无机盐培养基的配方为每升水中含有Na2HPO40.20 g，KH2PO41.0 g，NaCl 1.0 g，NH4NO30.5 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，CaCl20.1 g，FeCl30.01 g，琼脂15 g；pH=7.2。

1.7 生物富集系数

生物富集系数(bioconcentration factor, BCF)是描述化合物在生物体内累积情况的重要指标。BCF值是生物组织中化合物的浓度和试验结束后该化合物在土壤中的浓度之比。在本实验中即番茄果实中DBP、DEHP的检出量与相应盆栽后土壤中残留DBP、DEHP的检出量之比。

1.8 数据分析

应用SPSS 13.0软件对试验数据进行单因素方差分析，在α=0.05水平进行数据显著性差异检验。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 番茄植株不同部位中PAEs含量

(1)未灭菌番茄苗

不同PAEs染毒浓度下试验结束后，测定了未灭菌番茄植株各部位中DBP和DEHP的含量。由表2和表3可以看出，未灭菌番茄植株各部位DBP和DEHP的含量与土壤中DBP和DEHP浓度存在很好的相关性，随着土壤中DBP和DEHP污染浓度由低到高，番茄植株各部位对DBP和DEHP的积累能力增强。

未灭菌番茄植株各部位DBP含量顺序为果实>根>叶>茎，无论污染水平高低，各部位中DBP的含量表现出相同的顺序。DEHP含量顺序为根>果实≥叶≥茎。

表1 污染土壤中邻苯二甲酸正丁酯(DBP)和邻苯二甲酸异辛酯(DEHP)的初始浓度Table 1 Initial concentration of dibutyl phthalate (DBP) and di-2-ethylhexyl phthalate (DEHP) in polluted soil

注：表中数值为平均值±标准差。

Note: The data in the
Table were average value ± standard deviation.

同一污染水平下根系DEHP含量均高于DBP，而在果实和茎叶中DBP的含量均高于DEHP。可能是因为DBP的分子量和KOW较小，不易被土壤吸附，更容易被番茄根系吸收并向地上部位(茎、叶和果实)运移，而DEHP的分子量和KOW较大，更容易被土壤吸附滞留在番茄根部[21]。这与大棚中实地调查蔬菜中PAEs的污染结果相一致。

(2)灭菌番茄苗

表4和表5为不同PAEs染毒浓度下，试验结束后无菌番茄植株各部位DBP和DEHP含量。不同染毒浓度下生长的番茄植株，其果实、根、茎和叶中均检出DBP和DEHP，番茄植株各部位中DBP和DEHP含量与土壤中DBP和DEHP污染浓度密切相关，番茄植株各部位DBP和DEHP含量顺序与未灭菌番茄基本一致。

表2 未灭菌番茄植株各部位DBP含量(鲜重)Table 2 Content of DBP in different parts of non-sterilized tomato plants (fresh weight)

注：表中数值为平均值±标准差，不同大写字母表明同一处理不同部位含量差异达0.05显著水平，不同小写字母表示同一部位不同处理间含量差异达0.05显著水平，下同。

Note: The data in the
Table were average value ± standard deviation. Values in each row followed with different capital letters (A, B, C, D) indicated significant differences between different parts samples. Values in each line followed with different lowercase letters (a, b, c) indicated significant differences between different spiking PAE concentrations. The same below.

表3 未灭菌番茄植株各部位DEHP含量(鲜重)Table 3 Content of DEHP in different parts of non-sterilized tomato plants (fresh weight)

表4 无菌番茄植株各部位DBP含量(鲜重)Table 4 Content of DBP in different parts of sterilized tomato plants (fresh weight)

表5 无菌番茄植株各部位DEHP残留量(鲜重)Table 5 Content of DEHP in different parts of sterilized tomato plants (fresh weight)

2.2 不同处理方式土壤中DBP和DEHP的残留特征

表6为不同处理方式土壤中DBP和DEHP的残留量。无论种植番茄前土壤中PAEs污染水平高低，4个不同处理方式土壤中DBP和DEHP的残留量顺序均为：灭菌土壤组>灭菌土壤种植番茄苗组>未灭菌土壤组>未灭菌土壤种番茄苗组。显而易见，同一污染水平下灭菌处理后土壤中的DBP和DEHP残留量大大超过对应的未灭菌处理组，可能是因为灭菌后土壤中微生物失去活性，这说明微生物活性对土壤中污染物的降解起着至关重要的作用[21]。

不同处理方式中，未灭菌土壤种植番茄组DBP和DEHP的削减能力最强，高达96.39%，更进一步说明了DBP和DEHP的削减是番茄苗栽培过程中植物和微生物共同作用的结果。这除了番茄植株的吸收富集作用外，可能随着番茄植株的生长，植物根系分泌物为根际微生物的生存提供了碳源和能源，使得利用DBP和DEHP的微生物数量增加，从而大大提高了DBP和DEHP的削减能力[22-23]。

2.3 收获期后不同处理组土壤中微生物种类和数量

低、中、高3个不同污染水平的土壤种植番茄，在收获期后土壤中可培养细菌、真菌和PAEs可降解菌数量(CFU·g-1土)如图1所示。由图1可以看出：

(1)有番茄苗组土壤中可培养细菌、真菌和PAEs可降解菌的数量均大于等于无番茄苗组，比值分别介于4.5～11.0、1.0～10.0和2.1～2.6之间。这说明番茄在生长过程中番茄植株根系分泌的碳源和能源促进了根际微生物的生长和繁殖，显著提高了根际微生物数量和活性，研究表明，根际土壤中微生物数量一般比非根际土壤高5～20倍，最高可达100倍[22-23]。进一步说明了DBP和DEHP的削减是番茄苗栽培过程中植物根系分泌物促进了根际微生物及降解菌的生长，进而促进了PAEs的降解，因此可以说明PAEs的削减是番茄苗栽培过程中植物和微生物协同作用的结果。

(2)可培养细菌和真菌数量随着PAEs初始浓度的增加而降低，而PAEs可降解菌数量随PAEs初始浓度的增加而增加，增加幅度不大。这可能是因为PAEs对可培养细菌和真菌有一定的毒害作用，使得一部分可培养细菌和真菌在PAEs污染的环境中无法生存，导致其数量随PAEs初始浓度的增加而降低；而可降解菌是在PAEs污染环境中能够存活下来的那部分微生物，随着时间的延长和PAEs初始浓度的增加，可降解菌对PAEs产生一定的耐受作用。

2.4 番茄果实对DBP和DEHP的富集

表7为番茄果实对PAEs的生物富集系数，无论灭菌与否，随着土壤中DBP和DEHP污染水平的增加，番茄果实对DBP和DEHP的富集系数降低，即污染严重的地方番茄果实对DBP和DEHP的富集系数较低，这与前人研究水生植物对有机污染物的富集时的结果一致[24-25]。

表6 收获期后不同处理组土壤中DBP和DEHP残留量Table 6 Residual amount of DBP and DEHP in soils of different treatments after harvest

注：表中数值为平均值±标准差，不同大写字母表明不同处理方式同一染毒浓度土壤残留量差异达0.05显著水平，不同小写字母表示同一处理方式不同染毒浓度土壤残留量差异达0.05显著水平。

Note: The data in the
Table were average value and standard deviation. Values in each row followed with different capital letters (A, B, C, D) indicated significant differences between different treatment methods. Values in each line followed with different lowercase letters (a, b, c) indicated significant differences between different spiking PAE concentrations.

图1 收获期后土壤中微生物含量注：PAEs表示邻苯二甲酸酯；低、中、高表示PAEs的3个不同污染水平，其浓度分别为10.0、20.0和50.0 mg·kg-1。Fig. 1 The content of microorganisms in soils after harvest Note: PAEs stands for phthalate esters. Low, medium and high indicated three different levels of PAE pollution, and the concentration were 10.0, 20.0 and 50.0 mg·kg-1, respectively.

未灭菌番茄果实对DBP和DEHP的富集系数大于无菌番茄果实，其比值分别为11.3～21.7和3.7～8.4。这可能是由于未灭菌土壤中DBP和DEHP容易被微生物降解，土壤中DBP和DEHP含量较低的缘故。

番茄果实对DBP的富集系数大于DEHP，这与前人报道的蔬菜、花生对PAEs的富集结果相一致[26,12]。这可能与污染物的理化性质(水溶解度、挥发性和Kow等)有关，DBP的Kow值和相对分子量较DEHP低，在土壤中更容易挥发和降解导致土壤中其残留量较小，而DEHP亲脂性强、支链较长，难以在土壤中降解导致土壤中其残留量较大[25]；还可能是DBP和DEHP在植物体内的迁移能力不同所造成的，植物可以通过其根系从土壤间隙水中吸收有机化合物，而这种能力的强弱与被吸收的有机物的Kow值有关[27-28]。

综上所述：(1)番茄植物根系、茎、叶和果实均可以吸收PAEs类化合物，各部位中DBP和DEHP含量与土壤中DBP和DEHP的污染水平成正相关。相同处理的番茄茎、叶和果实中DBP含量均高于DEHP，而番茄根系中DEHP的含量高于DBP。(2)未灭菌组土壤中PAEs含量均低于灭菌组，有番茄苗组土壤中PAEs类化合物含量均低于无番茄苗组。(3)有番茄苗组土壤中可培养细菌、真菌和PAEs可降解菌的数量均大于等于无番茄苗组。(4)未灭菌土壤种植番茄苗组DBP和DEHP的削减能力最强，高达96.39%。番茄植物生长过程中增强了微生物对污染物的削减能力，番茄植物本身的吸收富集也削减了污染物，但造成了番茄的污染，食用果实可能存在一定的风险。

表7 番茄果实对PAEs的富集系数Table 7 Bioaccumulation factors of phthalate acid esters (PAEs) in tomato fruit