黄苑，苏晓鸥，张维，齐香荣，林刚

中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所，农业部农产品质量安全研究重点实验室，北京 100081

多氯联苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)是一类高温氯化合成的氯代联苯同系物，具有持久性、半挥发性、生物蓄积性和潜在毒性等特征，同时具有内分泌干扰效应，是一类典型的环境内分泌干扰物(endocrine disruptive chemical, EDCs)。因其良好性能曾被广泛生产和使用，到20世纪80年代左右停产[1]，但PCBs至今仍广泛存在于大气、飘尘、水体和土壤中[2-4]，并在水陆生动物包括高等哺乳动物体内检出，甚至在人体脂肪组织、母乳和血清中亦有检出[5-8]。PCBs分为类二噁英多氯联苯(dioxin-like polychlorinated biphenyls, DL-PCBs)和非类二噁英多氯联苯(non-dioxin-like polychlorinated biphenyls, NDL-PCBs)两大类，DL-PCBs因其化学结构与二噁英相似，较NDL-PCBs具有更强的毒性作用。PCB118是12种DL-PCBs之一，Kerchich等[9]报道PCB118在垃圾焚烧后的灰分和烟雾中均有较高的暴露水平，占据DL-PCBs总量的67%；在我国东部电子垃圾拆解工人血清中，PCB118是检出率很高的PCBs单体之一[10]。流行病学调查显示，PCB118暴露对代谢紊乱、行为异常、内分泌干扰及生殖异常甚至癌症等有关[11-14]。

针对PCBs内分泌干扰的已有研究主要集中于甲状腺素和雌激素干扰效应两大方面，对神经内分泌干扰的研究相对较少。而神经内分泌可通过下丘脑-垂体-性腺轴(hypothalamus-pituitary-gonad, HPG)参与调控生殖内分泌，在机体生殖和发育过程中发挥很大的作用。GnRH神经元作为HPG轴的关键靶标，既参与合成和分泌促性腺激素释放激素(gonadotropin-releasing hormone, GnRH)，又是调控哺乳动物生殖系统的最终共同通路。已有研究表明，Aroclor 1254和PCB118等PCBs混合物或单体能够在细胞水平上干扰GnRH的合成和分泌[15-16]，但具体的信号机制尚未深入探究。因此，本研究以小鼠下丘脑永生GnRH神经元离体细胞系GT1-7细胞为模型，从细胞存活率、GnRH分泌水平和Kisspeptin/GPR54信号通路关键调控因子表达等方面探究PCB118对GT1-7细胞GnRH分泌的影响和作用机制，为进一步揭示PCBs发挥内分泌干扰效应的毒性机理奠定基础。

1 材料与方法(Materials and methods)

1.1 实验材料

小鼠下丘脑永生GnRH神经元离体细胞系GT1-7细胞株由军事医学科学院彭双清研究员馈赠。细胞培养：GT1-7细胞培养于含10%胎牛血清和1%青链霉素双抗的DMEM培养基中，置于37 ℃、5% CO2的细胞培养箱中培养。24 h更换一次培养液，待细胞生长融合达80%～90%后，用PBS溶液洗涤细胞2～3次，加入适量0.05%胰酶-EDTA溶液消化1 min，1 000 r·min-1离心4 min，弃去上清液，用新鲜的完全培养基重悬细胞，按照1∶3比例传代。

1.2 实验试剂

PCB118标准品(德国DR公司，纯度为99.5%)，10 mg PCB118溶于612.34 μL二甲基亚砜(DMSO)，配制成50 mmol·L-1的母液，常温保存备用。DMEM高糖培养基、胰蛋白酶液、青链霉素双抗、RIPA蛋白裂解液、PMSF和ECL化学发光试剂盒均购自北京中科迈晨科技有限公司；胎牛血清购自美国Gibco公司；二甲基亚砜(DMSO)购自美国Sigma公司；CCK-8检测试剂盒购自日本Dojindo公司；乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；小鼠GnRH酶联免疫标记检测试剂盒购自美国BIM公司；BCA蛋白定量试剂盒购自美国CST公司；SurePAGETM蛋白预制胶购自中国金斯瑞生物科技有限公司； G蛋白偶联受体54(G-protein-coupled receptor 54，GPR54)一抗、磷脂酶C(phospholipase C, PLC)一抗和蛋白激酶C(protein kinase C, PKC)一抗购自美国Abcam公司；GnRH一抗购自美国Lifespan公司；β-actin一抗购自上海爱必信生物科技有限公司；HRP标记山羊抗鼠二抗、HRP标记山羊抗兔二抗购自北京博奥龙免疫技术有限公司。

1.3 主要仪器

1300 SERIES A2型生物安全柜(美国Thermo Scientific公司)；Synergy HTX多功能酶标仪(美国BioTek公司)；Mini-PROTEAN 4垂直电泳槽和Mini Trans-Blot Cell转印槽(美国Bio-Rad公司)；Tanon 5200全自动化学发光成像分析系统(上海天能科技有限公司)。

1.4 实验方法

1.4.1 细胞存活率实验

取对数期生长良好的GT1-7细胞，以每孔5×103个的密度接种于96孔细胞培养板中，置于细胞培养箱(37 ℃、5% CO2)预培养24 h，每组设置6个重复。加入含不同浓度PCB118的DMEM完全培养基(0、0.05、0.5、5、50、500、5 000和50 000 nmol·L-1，DMSO≤0.1%)，设置DMSO对照组(浓度为0.1%)，继续培养6、12、24和48 h。之后，每孔加入CCK-8试剂10 μL，置于细胞培养箱继续孵育1 h，酶标仪测定450 nm吸光度值(A450值)，设置650 nm作为参考波长，试验至少重复3次。计算各组平均A值和细胞相对存活率，细胞相对存活率(%)=(A染毒组-A背景对照)/(A对照组-A背景对照)×100%。

1.4.2 LDH活性检测

取生长良好的GT1-7细胞接种于96孔板中，每组设置6个重复，置于细胞培养箱预培养24 h后进行染毒处理，试验分组包括背景空白对照孔(无细胞不完全培养基)、样品对照孔(未经毒物处理的溶剂对照细胞孔)、样品最大酶活性对照孔(未经毒物处理的用于后续裂解的细胞孔)和毒物处理样品孔(不同浓度PCB118：0、50、500、5 000、50 000 nmol·L-1)；置于细胞培养箱继续培养24 h，在检测时间点前1 h，在样品最大酶活对照孔中加入20 μL乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放剂，置于细胞培养箱中孵育1 h后400 g离心5 min；每孔取出120 μL上清液至新的96孔板相应孔中；按照说明书现配LDH检测工作液，每孔加入60 μL工作液；室温避光孵育30 min后测定490 nm波长处吸光度值(A490值)；将测得的各组吸光度减去背景空白对照孔吸光度后计算LDH活力(%)，LDH活力(%)=(A处理样品-A样品对照)/(A细胞最大酶活性对照-A样品对照)×100%。

1.4.3 GnRH分泌量检测

将GT1-7细胞接种于6孔板中，预培养24 h后使用无血清的不完全培养基饥饿处理12 h，更换含有不同浓度PCB118的完全培养基(0、0.05、5、500和50 000 nmol·L-1)处理细胞6 h和24 h，收集细胞培养上清液用于GnRH分泌量测定，细胞用于Kisspeptin/GPR54信号通路分析。应用小鼠GnRH酶联免疫标记检测试剂盒检测GT1-7细胞培养上清液中GnRH分泌量。酶标仪测定450 nm处吸光度值，根据标准品绘制的GnRH标准曲线计算样品GnRH浓度。

1.4.4 Western Blot

细胞接板和染毒同1.4.3。吸除细胞培养上清液后，用预冷的PBS洗涤细胞，加入细胞裂解液裂解60 min，收集细胞裂解物，12 000 r·min-1、4 ℃离心10 min，收集上清液。BCA法测定蛋白浓度。加入5×SDS蛋白上样缓冲液，99 ℃加热10 min，点样并进行凝胶电泳。电泳结束后将分离的蛋白条带转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，4 ℃一抗孵育过夜，TBST洗膜3次，每次5 min。室温孵育二抗1 h，TBST洗膜3次，每次5 min。加入ECL化学发光显色液，利用全自动化学发光凝胶成像系统拍照并分析条带的灰度值(IDV值)，计算IDV目的蛋白/IDV内参蛋白值，获得目的蛋白的相对表达量。

1.5 数据统计分析

2 结果(Results)

2.1 PCB118对GT1-7细胞增殖的影响

不同浓度PCB118作用GT1-7细胞6、12、24和48 h后，细胞存活率的变化结果如图1所示。从剂量效应上看，处理6 h，PCB118对GT1-7细胞的存活率无显著影响；处理12 h和48 h，随PCB118作用浓度增加(0.05～50 000 nmol·L-1)，各浓度组与对照组相比均能显著降低细胞存活率(P<0.05或P<0.01)；处理24 h，随PCB118作用浓度增加(0.5～50 000 nmol·L-1)，各浓度组均能显著降低细胞存活率(P<0.05或P<0.01)。从时间效应上看，处理12 h，0.5～50 000 nmol·L-1剂量组中细胞存活率显著(P<0.05或P<0.01)低于6 h；处理24 h，0.05～50 000 nmol·L-1剂量组中细胞存活率显著(P<0.05或P<0.01)低于6 h；处理48 h，各剂量组细胞存活率与6 h时细胞存活率相比较均表现出显著(P<0.01)差异性。结果表明，随着作用时间延长，PCB118以剂量依赖性方式显著降低GT1-7细胞存活率，呈现一定的剂量效应和时间效应。

图1 PCB118对GT1-7细胞存活率的影响注：细胞存活率表示为3次独立试验的平均值±标准差(n=6)；* P<0.05、** P<0.01表示与同时间点 对照组相比差异显著；^ P<0.05、^^ P<0.01表示与6 h相比差异显著。Fig. 1 Effects of PCB118 on cell viability of GT1-7 cells Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group; ^ P<0.05, ^^ P<0.01, compared to the 6 h group.

2.2 PCB118对GT1-7细胞LDH释放的影响

不同浓度PCB118(50、500、5 000和50 000 nmol·L-1)处理GT1-7细胞24 h后，各浓度组培养基上清液中LDH活力分别为阳性对照组(最大酶活性对照孔)的4.23%±0.91%、3.97%±0.78%、3.77%±0.67%和15.52%±1.56%。50、500和5 000 nmol·L-1PCB118未造成细胞培养基上清液中的LDH释放量增加，50 000 nmol·L-1PCB118能够显著促进LDH的释放(P<0.01)，结果如图2所示。这说明只有高浓度PCB118才会引起细胞膜通透性的增加，具有明显的细胞毒性作用。

2.3 PCB118对GT1-7细胞GnRH分泌的影响

将不同浓度PCB118(0、0.05、5、500和50 000 nmol·L-1)对GT1-7细胞分别染毒6 h和24 h，ELISA法检测细胞培养液内GnRH浓度，并用细胞内总蛋白含量进行标准化，结果如图3所示。PCB118染毒6 h后，5和500 nmol·L-12个浓度组细胞培养液中GnRH的含量显著低于对照组(P<0.05)，50 000 nmol·L-1浓度组细胞培养液中GnRH的含量显著低于对照组(P<0.01)；PCB118染毒24 h后，0.05和5 nmol·L-1浓度组GnRH的变化无明显统计学差异，500和 50 000 nmol·L-1浓度组细胞培养液中GnRH的含量显著低于对照组(P<0.05)。

图2 PCB118对GT1-7细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放的影响注：数值为处理组细胞LDH释放量相对于阳性对照组的比值， 以3次独立试验的平均值±标准差表示(n=6)； 与对照组相比，*P<0.05、** P<0.01。Fig. 2 Effects of PCB118 treatment on the release of lactate dehydrogenase (LDH) from GT1-7 cells Note: Date represented the LDH leakage content of the treatment group relative to the positive control group, and were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=6 for each replicate. *P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group.

图3 PCB118对GT1-7细胞GnRH分泌的影响注：用细胞内总蛋白含量标准化细胞培养液中GnRH含量，数据表示3次独立试验的平均值±标准差(n=3)；与对照组相比，*P<0.05、** P<0.01。Fig. 3 Effects of PCB118 treatment on GnRH secretion in GT1-7 cells Note: Date were described as the concentration of GnRH in cell culture medium relative to the total proteins in GT1-7 cells, and expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, **P<0.01, compared to the control group.

图4 PCB118染毒6 h和24 h后Kisspeptin/GPR54信号通路蛋白的表达情况Fig. 4 The expression of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT1-7 cells treated with PCB118 for 6 h and 24 h

2.4 PCB118对Kisspeptin/GPR54信号通路的影响

PCB118分别对GT1-7细胞染毒6 h和24 h，提取胞内总蛋白并定量，用Western Blot法分析Kisspeptin/GPR54信号通路上关键蛋白的表达情况，应用Image J软件对结果进行定量分析。结果如图4和图5所示，PCB118染毒GT1-7细胞6 h后，0.05 nmol·L-1PCB118对蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC的表达无显著影响；5、500和50 000 nmol·L-1PCB118均能显著降低蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC表达水平(P<0.01或P<0.05)。染毒24 h后，500和50 000 nmol·L-1PCB118均能显著降低蛋白GnRH、GPR54、PLC和PKC表达水平(P<0.01或P<0.05)。

3 讨论(Discussion)

本研究主要围绕PCB118对GT1-7细胞的增殖毒性作用和GnRH分泌水平的影响及其机制，分析了PCB118对GT1-7细胞的细胞存活率、GnRH分泌以及Kisspeptin/GPR54信号通路在PCB118干扰GT1-7细胞分泌GnRH中的作用，以期阐明PCB118的神经内分泌干扰效应及潜在机制。研究发现，PCB118对GT1-7细胞具有一定的细胞增殖毒性并能抑制GT1-7细胞分泌GnRH，下调GnRH、GPR54、PLC和PKC等关键蛋白表达水平，表明Kisspeptin/GPR54信号通路可能介导了PCB118干扰GT1-7细胞GnRH的分泌。

图5 PCB118染毒6 h和24 h后Kisspeptin/GPR54信号通路相关蛋白的定量分析注：数据表示3次独立试验的平均值±标准差(n=3)；与对照组相比，* P<0.05、** P<0.01。Fig. 5 Quantitative analysis of associated proteins on Kisspeptin/GPR54 signaling pathway in GT1-7 cells treated with PCB118 for 6 h and 24 h Note: Data were expressed as mean±SD of three independent experiments, n=3 for each replicate. * P<0.05, ** P<0.01, compared to the control group.

CCK-8实验结果表明，PCB118具有抑制GT1-7细胞增殖的作用，随PCB118暴露剂量(0.05～50 000 nmol·L-1)的增加，细胞存活率逐渐降低，呈现明显的剂量效应关系；随PCB118暴露时间(6～48 h)的延长，细胞存活率呈现下降趋势，并呈现一定的时间效应，。Dickerson等[15]已研究发现PCB118(0.1～100 μmol·L-1)体外暴露GT1-7细胞24 h内能够抑制细胞增殖，而本研究发现更低浓度PCB118仍然具有抑制GT1-7细胞增殖的作用。Hashmi等[17]也发现PCB118(1～20 μg·mL-1)作用人胚肺成纤维细胞12～48 h后具有显著抑制细胞增殖的作用。但Yang等[13]发现，低浓度PCB118(0.025～25 nmol·L-1)并未显著抑制大鼠甲状腺细胞增殖，只在250～25 000 nmol·L-1浓度范围内表现出显著性抑制作用。这提示PCB118具有抑制细胞增殖的作用，但不同类型细胞对PCB118敏感度存在差异，神经细胞可能对PCB118更加敏感。LDH释放实验结果显示，只有50 000 nmol·L-1PCB118对细胞膜产生明显的损伤，从而显著促进LDH释放。虽然低浓度组并未与对照体现出显著性差异，但CCK-8实验结果表明，低浓度PCB118具有一定的细胞增殖毒性，因而其低剂量毒性效应仍不容忽视。根据上述结果并结合PCB118在环境介质和动物机体中的暴露水平[9,18]，选择0.05、5、500和50 000 nmol·L-1的低中高浓度作为研究PCB118干扰GT1-7细胞GnRH分泌的浓度。

GnRH由下丘脑神经元合成并分泌，经垂体门脉系统调节腺垂体的促性腺激素分泌，进而调控性腺激素水平和生殖功能[19]。目前，已有研究表明PCBs可以干扰神经内分泌系统，影响大鼠脑组织中GnRH表达，进而影响机体性别分化，造成生殖功能紊乱[20]；Khan等[21]也发现多氯联苯混合物Aroclor 1254(主要成分是PCB118)能损伤鱼类下丘脑前部中GnRH的合成和释放。本研究发现，不同浓度PCB118处理GT1-7细胞不同时间对GnRH分泌具有不同程度的抑制作用。处理6 h，5、500和50 000 nmol·L-1PCB118能显著抑制GT1-7细胞GnRH的分泌，这与Dickerson等[15]发现的PCB118(0.1～10 μmol·L-1)作用GT1-7细胞4 h促进GnRH分泌的结果不一致，可能与实验中细胞状态、药物干预浓度和GnRH脉冲分泌时间有关。细胞培养上清液中GnRH由具有活性的GT1-7细胞分泌，PCB118对GT1-7细胞增殖的抑制作用可能是造成GnRH分泌量降低的原因之一。但作用6 h时，PCB118并未显著抑制细胞增殖，因此短时间内GnRH分泌量的改变可能并不是由细胞增殖的变化引起的。处理GT1-7细胞24 h，高浓度PCB118能显著抑制GT1-7细胞分泌GnRH，这与Dickerson等[15]发现的PCB118(1～100 μmol·L-1)作用GT1-7细胞24 h显著抑制GnRH分泌的结果一致。这种抑制作用一方面是由于PCB118干扰GT1-7细胞增殖，另一方面可能是PCB118间接干扰了某些调节GnRH功能的神经递质信号通路。

GnRH的合成和分泌过程受到诸多因子调控，其中，Kisspeptin/GPR54信号通路是参与GnRH脉冲式分泌的关键信号机制。GnRH神经元受到其上游神经元(kiss-1)的直接调控，kiss-1神经元内的kiss-1基因可以编码Kisspeptin多肽，Kisspeptin通过与其受体GPR54[22]结合激活PLC反应途径，从而激活下游激酶如PKC等磷酸化级联反应途径，并活化细胞膜上非选择性阳离子通道以及抑制K+的外向电流，达到GnRH神经元的去极化，从而参与调控GnRH的合成和分泌[23-25]。GPR54、PLC和PKC等均是Kisspeptin/GPR54信号通路中的关键调控蛋白。已有研究表明，在GT1-7细胞中，Kisspeptin/GPR54可通过PKC信号通路调节下游细胞内钙离子通量从而影响GnRH的分泌[26]。因此，本研究初步分析了PCB118对Kisspeptin/GPR54信号通路中关键蛋白表达水平的影响。结果表明，Kisspeptin/GPR54信号通路上关键蛋白的变化趋势与PCB118影响GT1-7细胞分泌GnRH的变化趋势基本一致，PCB118显著下调GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白的表达，并呈现一定的剂量依赖性。虽然类环境剂量组中0.05 nmol·L-1PCB118对GnRH分泌量和GnRH、GPR54、PLC和PKC等蛋白的表达均无显著影响，但5 nmol·L-1PCB118作用6 h，在不影响细胞增殖的情况下即可抑制GT1-7细胞GnRH的合成和分泌，并显著下调Kisspeptin/GPR54信号通路上GPR54、PLC和PKC等蛋白的表达，这表明环境剂量下PCB118仍然具有一定的内分泌干扰效应。值得注意的是，5 nmol·L-1作用24 h时，PCB118对GT1-7细胞的GnRH分泌和相关蛋白的表达影响并不显著，推测可能存在其他调控机制。已有研究表明，细胞外信号调节激酶(extracellular signal-regulated kinase)ERK和cAMP/PKA信号通路参与Kisspeptin刺激GT1-7细胞GnRH受体的表达[27]，该信号通路是否参与PCB118对GT1-7细胞GnRH分泌的影响仍需进一步研究。500 nmol·L-1PCB118作用6 h和24 h后，均能显著抑制GnRH分泌和蛋白的表达，虽然该浓度稍高于正常的环境水平，但在长期生活于受PCBs污染的地区或接触电子垃圾的动物或人体内属于正常水平，因而其所带来的危害不容忽视。50 000 nmol·L-1PCB118远高于环境介质中的水平，在设定的时间范围内，能稳定地抑制GnRH分泌并下调Kisspeptin/GPR54信号通路中相关蛋白的表达水平。由此说明，PCB118可通过干扰Kisspeptin/GPR54信号通路中相关蛋白的表达而发挥神经内分泌干扰作用。

本研究表明，PCB118在环境剂量下，仍然对GT1-7细胞具有一定的细胞增殖毒性和GnRH分泌的干扰效应，在抑制GnRH分泌的同时能够下调Kisspeptin/GPR54信号通路关键蛋白的表达，提示该信号通路可能参与了PCB118影响GT1-7细胞GnRH的分泌。Dickerson等[15]已经发现雌激素受体(estrogen receptor, ER)抑制剂可以拮抗PCB118对GT1-7细胞GnRH分泌的抑制作用，提示PCB118可通过ER途径干扰GnRH分泌。本试验提供了PCB118干扰GT1-7细胞GnRH分泌的另一潜在分子机制，但是Kisspeptin/GPR54信号通路在介导PCB118发挥神经内分泌干扰效应中的具体作用机制，以及其他信号通路的介入情况，仍需要进一步深入研究。