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HPLC法测定知柏地黄丸中毛蕊花糖苷的含量

2019-09-16李腾汤莹

中国中医药现代远程教育 2019年16期
关键词:知柏毛蕊花熟地黄

李腾 汤莹*

(华中科技大学同济医学院附属同济医院药学部,湖北 武汉 430030)

知柏地黄丸系中药成方制剂,由熟地黄、知母、黄柏、山茱萸(制)、山药、牡丹皮、茯苓、泽泻8味中药组成,具有滋阴清热的功效。用于阴虚火旺,潮热盗汗,口干咽痛,耳鸣遗精,小便短赤。该制剂选药精当,力有所专,补泄均衡,配伍严谨,临床应用广泛,疗效确切。制剂质量标准执行《中华人民共和国药典》(2015版)标准,标准中除常规检查和理化鉴别外,对制剂中的马钱苷(来源于山茱萸)和丹皮酚(来源于牡丹皮)含量设定了质控限值。制剂中熟地黄是方中主药,具有补血滋阴,益精填髓等功效,指标成分为毛蕊花糖苷,临床上应用较为广泛,用于血虚萎黄、心悸怔忡、月经不调、崩漏下血、肝肾阴虚、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精、内热消渴、眩晕耳鸣、须发早白等[1-4]。我们查阅文献了解到,目前虽有知柏地黄丸临床疗效及质量控制相关的研究报道[5-6],但尚未有对毛蕊花糖苷进行含量限值控制的相关研究报道。为了进一步完善知柏地黄丸的质量标准[7],本文建立了HPLC法测定知柏地黄丸的毛蕊花糖苷含量的方法,方法简便快速、准确度高、专属性强,可用于知柏地黄丸中毛蕊花糖苷的测定,为提高知柏地黄丸质量标准提供借鉴。

1 材料

1.1 仪器 安捷伦1260型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);超声波清洗器(KQ-500DE型,昆山市超声仪器有限公司);赛多利斯BP211D电子分析天平(德国赛多利斯股份公司);RC806型溶出试验仪(天津市天大天发科技有限公司);HH-2型数显恒温水浴锅(国华电器有限公司);电热恒温鼓风干燥箱(黄石市恒丰医疗器械有限公司)

1.2 药品与试剂 毛蕊花糖苷对照品(中国食品药品检定研究院,批号:111530-201713);知柏地黄丸(北京某厂(批号:180826、180908、180919);知母、黄柏、山茱萸、牡丹皮、山药、茯苓和泽泻药材(均购自安徽天马中药饮片科技有限公司);乙腈,甲醇为色谱纯(美国Merck公司);其他试剂均为分析纯,水为纯化水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱:Agilent C18(4.6 mm×250 mm×5 μm);流动相:乙腈-0.1% 乙酸溶液(13∶87,V/V);流速:1.0 mL/min;检测波长:334 nm;柱温:33℃;进样量:10 μL[8-10]。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品溶液的制备 精密称取毛蕊花糖苷对照品2.08 mg,用流动相为溶剂制成10 mL的毛蕊花糖苷溶液,即得。

2.2.2 供试品溶液的制备 取本品适量,研碎,过6号筛,取约1 g,精密称定,置于棕色容量瓶中,精密加入50% 甲醇50 mL,称定质量,浸泡30 min,超声(功率:50 W,频率:40 kHz)处理30 min,放至室温,再称定质量,用50%甲醇补足差重,摇匀,过滤,精密吸取25 mL续滤液,置于恒温水浴锅60℃下挥干,残渣加流动相定容至5 mL,过0.45 μm滤膜,即得。

2.2.3 阴性对照溶液的制备 取处方中除熟地黄外的其余药味,按知柏地黄丸的制法制备不含熟地黄的阴性对照制剂,按“2.2.2”项下方法制备阴性对照溶液。

2.3 阴性干扰试验 取对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各适量,按“2.1”项下色谱条件进样,记录色谱,见图1。由图1可见,毛蕊花糖苷峰相应的位置未见其他的干扰峰出现。

图1 高效液相色谱图

2.4 线性关系考察 精密称取毛蕊花糖苷对照品适量,精密吸取上述对照品溶液 (208 μg/mL)0.25、0.5、1、2.5、5 mL置于10 mL的容量瓶中,用流动相定容至刻度线,加上母液共配制成6个浓度对照品溶液,进样量均为10 μL,以进样浓度(mg/mL)为横坐标,峰面积值为纵坐标绘制标准曲线,计算的线性方程为y=226.13×x-1.0111,r=0.9998。结果表明,毛蕊花糖苷在5.2×10-3~208×10-3mg/mL浓度范围内线性关系良好。

2.5 精密度试验 精密吸取“2.2.1”项下对照品溶液适量,按照“2.1”项下的色谱条件重复进样6次,测定峰面积。结果,毛蕊花糖苷峰面积的RSD=0.92%,表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验 取“2.2.2”项下供试品溶液(批号:180826) 适量,分别于放置0、4、8、12、20、24 h时精密吸取10 μL,注入HPLC仪,按“2.1”项下色谱条件进样测定峰面积。结果,毛蕊花糖苷峰面积的RSD=1.18%,表明供试品溶液在24 h内质量稳定。

2.7 重复性试验 取样品(批号:180826)适量,共6份,分别按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件进样测定毛蕊花糖苷的峰面积并计算含量。结果,毛蕊花糖苷含量的RSD=1.37%,表明该方法的重复性良好。

2.8 加样回收率试验 精密称取已知含量的样品(0.906 6 mg/g)约1.0 g,分别精密加入低、中、高不同量的对照品六份,编号,然后按上述方法,最后稀释至25 mL,制备供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件测定含量,计算回收率,结果平均回收率为97.4%,RSD=1.28%,表明本方法可靠,见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.9 样品含量测定 分别取知柏地黄丸3批各适量,按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液,并按“2.1”项下色谱条件进样测定,记录色谱,计算含量。结果3批样品中毛蕊花糖苷平均含量分别为0.25、0.28、0.26 mg/丸。以80%的转移率计,制剂中毛蕊花糖苷不应少于0.21 mg/丸。

3 讨论

3.1 提取方法的选择 本实验预实验时比较了纯水、50%乙醇和75%乙醇三种提取溶剂,结果表明三种溶剂均能将毛蕊花糖苷提取完全,结合干膏得率和经济效益,最终采用50%乙醇做提取溶剂。比较了25、50,75,100倍提取溶剂的提取效率,结果表明50倍,75倍和100倍取溶剂的提取效率没有显著性差异,最终采用50倍提取容积提取。同时考察了超声波提取时间,最终确定超声波提取30 min。因此最终确定提取方法为:用50倍50%乙醇,超声波提取30 min。采用本法提取知柏地黄丸中的毛蕊花糖苷,准确可靠。

3.2 流动相的选择 本实验同期曾采用乙腈∶纯水、甲醇∶纯水和甲醇∶0.1%乙酸溶液作为流动相,同时考察了不同比例对色谱的影响,但实验结果显示要么杂质峰过多而目标峰不明显,要么峰形拖尾均严重。经过对比,结果表明采用乙腈-0.1% 乙酸溶液 (13∶87,V/V) 作为流动相,样品峰型最为稳定,杂质峰较少,保留时间适宜,灵敏度高,可为相关制剂中毛蕊花糖苷的含量测定提供一种新方法。

3.3 本研究的价值 中药制剂质量标准中的含量测定项首选君药,熟地黄为知柏地黄丸方中君药,其指标成分毛蕊花糖苷,应当设立毛蕊花糖苷为标准中含量测定项,参考本实验结果,建议知柏地黄丸中熟地黄含量以毛蕊花糖苷计不应少于0.21 mg/丸。本实验方法可快速测量知柏地黄丸中毛蕊花糖苷的含量,方法简便、结果准确、灵敏度高、重复性好,可为进一步提高知柏地黄丸的质量控制提供借鉴,同时可也为其他中成药制剂中熟地黄的质量控制提供参考。

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