焦芳艳 尹铁球 黄露萍 李勇 谭宇蓉

〔摘要〕 目的 分析2016年至2018年湖南省脑科医院铜绿假单胞菌的临床分布情况、耐药情况以及耐药菌株Ⅰ类整合子基因。方法 选取湖南省脑科医院2016年1月1日至2018年12月31日临床送检各类标本中分离出795株铜绿假单胞菌作为分析对象，就铜绿假单胞菌的临床分布情况以及耐药情况统计分析，2018年ICU分离的13株多重耐药菌株采用PCR扩增检测Ⅰ类整合子。结果 铜绿假单胞菌分布科室主要为神经外科（24.53%），其次为呼吸内科（22.26%）和重症医学科（13.21%）;铜绿假单胞菌对临床常用的20种抗生素耐药率和敏感率0-100%不等，多重耐药呈上升趋势;13株多重耐药菌株6株Ⅰ类整合子阳性。结论 及时统计细菌分布情况、药物的耐药率、敏感率，并对其进行分析，可以为临床合理用药提供依据，有效预防和控制感染。

〔关键词〕 铜绿假单胞菌;抗菌药物;耐药率;敏感率

〔中图分类号〕R378.99+1       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.06.019

〔Abstract〕 Objective To analyze the clinical distribution， drug-resistance and class I integron genes of drug-resistant strains of pseudomonas aeruginosa （PA） in the Brain Hospital of Hunan Province from 2016 to 2018. Methods A total of 795 PA separated from clinical specimens submitted for examination samples in the Brain Hospital of Hunan Province from January 1， 2016 to December 31， 2018 were regarded as analysis objects. The clinical distribution and drug-resistance of PA were statistically analyzed. In 2018， class I integron of 13 multiple drug-resistant strains separated from specimens submitted by ICU were detected by PCR amplification. Results Most of PA was from neurosurgery department （24.53%）， followed by the department of respiratory medicine （22.26%） and the department of critical care medicine （13.21%）. The drug-resistance rate and susceptibility rate of PA to 20 antibiotics commonly used in clinic ranged from 0-100%， with multiple drug-resistance on the rise. The class I integrons were detected positive in 6 of the 13 multiple drug-resistant strains. Conclusion Timely statistics and analysis of bacterial distribution， drug-resistance rate and susceptibility rate could provide the basis for rational drug use in clinics and effectively prevent and control infection.

〔Keywords〕 pseudomonas aeruginosa; antibacterial drug; drug-resistance rate; susceptibility rate

銅绿假单胞菌（pseudomonas aeruginosa， PA）是假单胞菌属代表菌种，广泛分布于自然界、土壤、水体、空气以及人类皮肤、肠道、呼吸道等中，其属于革兰阴性杆菌，是一种常见的条件致病菌，是医院感染的主要病原菌之一[1]。近年来，由于抗生素不合理使用以至于PA成为临床病原菌的主要菌种之一。由于其易定植、易变异、多重耐药等特性[2]，导致PA感染已成为临床治疗的瓶颈[3]。所以了解PA的临床感染的分布情况及药敏耐药、敏感特点十分重要，通过这些分析可以为临床合理用药提供依据，是加强医院感染控制的重要措施。

研究显示，PA的耐药机制较为复杂，其中包括群体感应系统、碳青霉烯酶、和外排泵等，近年研究也发现在整合子-基因盒系统中介导该菌由单一耐药向多重耐药发展过程时担任重要角色，我国多项研究表明基本为Ⅰ类整合子[4-6]。本研究分析总结了湖南省脑科医院2016-2018年临床分离的795株 的临床耐药情况，并对2018年分离自ICU的13株多重耐药菌株的Ⅰ类整合子进行了分析。

1 材料与方法

1.1  菌株来源及鉴定

选取2016年1月1日至2018年12月31日湖南省脑科医院患者临床分离到的（剔除重复标本）PA795株，质控菌株购自卫生部临床检验中心的PA ATCC27853、大肠埃细菌ACTT25922，细菌分离按照《全国临床检验操作规程》第3版[7]处理操作，采用全自动微生物鉴定仪进行细菌鉴定。

1.2  仪器与试剂

Vitek-2 Compact全自动微生物鉴定仪及配套试剂、TDR-300B plus天地人系统微生物鉴定仪及配套试剂，ABsteponeplus基因扩增仪，柯达凝胶成像系统，BIO-RAD电泳仪。DNA提取试剂盒为OMEGA试剂盒。

1.3  药敏试验

药敏试验操作、结果判定采用CLSI2016- 2018 年版标准推荐的最低抑菌浓度（MIC）法。多重耐药铜绿假单胞菌（multiresistant pseudomonas aeruginosa，MRPA）的判定：对下面5类抗菌药中的3类及以上药物耐药包括头孢菌素类（如头孢吡肟）、氟喹诺酮类（如左旋氧氟沙星）、碳青霉稀类（如美罗培南）、B-内酰胺酶抑制剂（哌拉西林/他唑巴坦）和氨基糖苷类（妥布霉素）。

1.4  整合子基因扩增

按照OMEGA试剂盒说明书提取DNA，参考文献[6]设计引物，引物intⅠ1-F和intⅠ1-R由湖南擎科生物技术有限公司合成，扩增条件为：95 ℃ 5 min;95 ℃ 20 s，52.5 ℃ 30 s， 72 ℃ 1 min，35 cycle. PCR产物经琼脂糖凝胶电泳凝胶成像分析。

1.5  统计学方法

所有实验数据采用WHONET 5.6软件及 SPSS

20.0软件进行分析。

2 结果

2.1  PA的分离情况

2016年1月1日至2018年12月31日3年临床共分离细菌6 475株，株数及占比如下：三年共分离795株（795/6475，12.28%），2016年281株（281/ 2269，12.38%），2017年216株（216/1930，11.19%），2018年298株（298/2706，11.01% ）。

2.2  PA在各临床标本中的分布情况

菌株主要来自住院患者的痰液78.49%（624/ 795）、伤口拭子6.04%（48/795）、支气管肺泡灌洗液4.78%（38/795）、尿液3.65%（29/795）、血液1.26%（10/795）、其他5.79%（46/795）等，见表1。

2.3  PA在各临床科室中的分布

本院由铜绿假单胞菌引起感染的临床科室较为多，几乎涉及所有科室，主要分布于神经外科、呼吸内科、重症医学科、神经内科、肿瘤科等等科室;主要科室株数及占比如下：神经外科分布24.53% （195/795）、呼吸内科22.26%（177/795）、重症医学科13.21%（105/795）、神经内科12.08%（96/795）、肿瘤科5.03%（40/795）、其他科室22.89%（182/795）等，具体见表2。

2.4  PA的季节分布

795例PA感染的季节分布，2016-2018年总体是秋季占比率最高，冬季次之，见表3。

2.5  PA对临床常用抗菌药物的耐药性敏感性

从以下监测数据观察到，我院三年合计PA耐药高达96.81%，对哌拉西林/他唑巴坦、头孢他啶、哌拉西林保持相对较高敏感率，对亚胺培南和美罗培南较敏感在60%～70%左右。PA对头孢唑啉、氨苄西林、头孢呋辛、头孢曲松、头孢吡肟、氯霉素、氨苄西林舒巴坦耐药率高。具体数据见表4。

2.6  与本院2010-2012年PA抗菌药物耐药率统计分析

与本院文献[8]2010-2012年合计统计分析，有11种抗菌药物的耐药率统计相同，其中有7种下降，2种上升，明显下降的有：庆大霉素、妥布霉素、环丙沙星、左旋氧氟沙星、阿米卡星、头孢吡肟，耐药率上升的有：头孢曲松、亚胺培南。

2.7  MRPA检出率分析

全院在795株PA分离中共分离出MRPA86株10.82%，MDPA在2016-2018年的检出率分别为6.54%（18/281）、10.9%（10.9/216）、14.77%（44/298），检出率呈上升趋势。

2.8  2018年分离自ICU的13株多重耐药菌株Ⅰ类整合子分析

分析结果显示，6株阳性，产物大小约500 bp（见图1），占46.2%，阳性率和文献报道相似[5-6]，表明整合子在铜绿假单胞菌的耐药性发展中起着重要的作用。

3 讨论

3.1  PA分布情况

PA是医院内获得性感染常见的条件致病菌之一，可引起严重的肺炎、菌血症、烧伤后感染、泌尿系统感染等[9]，在目前醫院感染中发挥重要作用[10]，且其感染率近年来不断增加[11]。从结果2.1可以看出我院PA在总分离菌株中比例较高，3年比例分布在11.01%～12.38%之间，比湖南省2017年度细菌耐药监测报告发布的细菌耐药数据显示PA占总分离菌株比8.03%，和2016年全国细菌耐药监测报告发布的数据显示PA在总分离菌株中约占9.03%都高。所以，本院的患者PA总体感染相对严重，医院需对PA感染者更加严密监测和加强相关的研究，一定避免PA在院内大规模的爆发感染。但本院结果显示近三年来，检出率有逐渐下降趋势。说明近些年由于上级部门和医院开始重视，但各临床科室并不能掉以轻心。从表2看标本来源广泛种类多，但还是以痰标本最多且占比高。和近些年统计文献相同[12-14]。此项显示，本室更应关注此类型标本及其菌的耐药情况，对其类型的标本进行进一步研究和总结，为临床提供更有价值的资料。从表3结果来看菌株科室分布前5名科室神经外科分布占 24.53%、呼吸内科22.26%、重症医学科13.21%、神经内科12.08%、肿瘤科5.03%，这可能是神经外科感染来源于患者基本手术及呼吸内科、神经内科患者多为老年病人，患者病程长、病情重、机体免疫力低下，在对重症科和肿瘤科患者进行抢救时常进行气管切开及插管等侵入性操作，同时这些患者常常伴有长时间的使用广谱抗菌药控制感染，容易引发机体菌群失调进而导致条件致病菌如铜绿假单胞菌感染增加。这与多文献研究[15-17]基本相符。所以相关临床科室需要特别注意PA感染的患者，注意每次此菌感染患者的耐药情况分析及动态病情变化，选择更适合患者的抗菌药物，尽量减少患者对此菌的多重耐药发生。从表4显示2016-2018年总体是秋季占比率最高。这可能是秋天气候冷暖善变，昼夜温差较大，使得呼吸道抵抗力下降有关[13]。这提醒临床对易感患者尤其注意这个季节需注意天气和昼夜温差变化，嘱咐患者保暖、加强营养，增强抵抗力，从而预防PA的感染。

3.2  PA耐药分析

PA具有多重耐药的特性，其耐药机制主要包括以下方面：（1）改变细胞膜和细胞壁结构，使其通透性下降，药物难以进入细胞内;（2）产生药物灭活酶如纯化酶、水解酶和修饰酶;（3）主动转运系统把抗生素排出;（4）产生β-内酰胺酶使β-内酰胺类抗生素开环失活;（5）改变药物作用的靶位，抑制细菌细胞壁生物合成，降低其与β-內酰胺类抗生素的亲和性[18]。表4数据显示3年中大多数药敏的敏感率耐药率相差不大，在20种抗菌药物中，合计敏感率高于70%以上有9种，从高至低为：替加环素、阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素、左旋氧氟沙星、环丙沙星、头孢吡肟、头孢他啶、美罗培南。合计敏感率在69%～60%左右有4种，从高至低为：哌拉西林/他唑巴坦、哌拉西林、氨曲南、亚胺培南。合计药敏的耐药率高于70%有7种以上从高至低为：氨苄西林、头孢唑林、头孢替坦、呋喃妥因、氨苄西林/舒巴坦、头孢呋辛、头孢曲松。从3年常规药敏变化来看：左旋氧氟沙星虽然敏感率较高但逐年略下降，美罗培南和氨曲南（16年没做）敏感率也是下降。环丙沙星、头孢他啶敏感性逐年上升。从结果“2.6”显示，近些年由于管理部门及医院对抗生素重视管理、控制及监测，本院的铜绿假单胞菌耐药率呈明显下降趋势。从结果“2.7”来看比较近年其他文献[16]统计MRPA，本院多重耐药率较低，但是近三年持续上升，而且每年上升比例不少，所以临床要引起重视。根据以上统计分析，对于单纯铜绿假单孢菌感染的患者推荐临床根据病情使用敏感率高于70%以上9种药，其中替加环素是目前极少见耐药的药物，可用作铜绿假单胞菌感染的患者最后一道防线的药物之一。而阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素为敏感度较高可作为临床一线的抗菌药物。而环丙沙星、头孢他啶、头孢吡肟可以作为目前临床上较常规安全性选用的抗菌药物。对于左旋氧氟沙星在安全选用的同时持续关注。而对于敏感率在69%～60%左右的4种及美罗培南来说，临床要慎重选用。尤其美罗培南、亚胺培南这类碳青霉稀类药物，近年来耐药检测率越来越高，一旦其耐药可用抗菌药物就有限，临床尽量限制性选择，这与郭良等[19]研究相符。当然，对临床来说尽量不用耐药率高于70%的7种药，而本院也需持续关注这7种耐药率高的药物，分析其耐药机制，为临床合理用药提供理论依据。对于复杂难治多种细菌感染，临床可以根据以上药敏药物敏感性联合搭配选药，慎用耐药率高的药敏药物。而对MRPA，临床更应高度重视其耐药危害性，根据本院提供抗菌药敏结果结合临床合理使用抗菌药物，防止或减慢多重耐药菌珠的产生。综上PA耐药分析，本院更应与临床加强沟通，更进一步总结分析与研究，为临床提供及时准确有效抗菌药物结果。

整合子是一种与耐药基因水平传播相关的可移动的基因元件，可以携带一个或多个耐药基因，在同种或不同种的细菌间发生水平传播，可导致多重耐药的发生[20]。整合子根据其整合酶编码基因序列的不同分类，目前发现至少有6种，其中Ⅰ类整合子最为常见[21]。Ⅰ类整合子在医院感染菌中广泛分布，而且由于抗菌药物在全球范围大量应用，也加速了Ⅰ类整合子流行和播散[4]。本研究初步表明，Ⅰ类整合子在铜绿假单胞菌的耐药性发展中可能发挥重要作用，我们将进一步加大标本量进行各类整合子基因分析，并进一步结合基因测序技术对整合子可变区中耐药基因进行研究分析，从而更加明确铜绿假单胞菌耐药性机制。

3.3  小结

综上分析，铜绿假单胞菌致病性较强，临床分布广泛，是医院内感染的重要病原菌。近些年由于管理部门的重视，医院对药物关注和监测，对药物耐药机制关注与研究，常用抗菌药物敏感性会越来越多，耐药率呈下降趋势。但是我们更不能忽视依然还有许多药物耐药率及MRPA持续增高，应该继续更应严格管理抗菌药物，加强抗菌药物药敏检测，控制医院感染，有效预防和控制临床患者的PA感染，为临床合理有效使用抗菌药物提供科学依据。

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