郝磊 孙福仁 高晗 李雪利 田方 李振江 李军山

摘 要：为了进一步研究山楂配方颗粒的质量控制方法，以山楂标准汤剂为研究对象，采用高效液相色谱仪与GL science C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）色谱柱，以乙腈-0.4%磷酸为流动相，柱温为30 ℃，流速为1.0 mL/min，检测波长为254 nm，应用特征图谱技术以及中药指纹图谱相似度评价软件提取山楂标准汤剂特征图谱中的特征成分。研究表明，15批山楂标准汤剂中共确定了7个特征峰，分离度较好，且峰面积较大，易于识别，使用参照物标定了3个特征峰成分，各共有峰相对保留时间的RSD值小于2.5%。所建立的山楂标准汤剂HPLC特征图谱方法可靠、稳定，为山楂配方颗粒质量控制提供了一定的参考。

关键词：中药化学;山楂标准汤剂;特征图谱;绿原酸;金丝桃苷;异槲皮苷

中图分类号：R284.1 文献标志码：A

doi： 10.7535/hbgykj.2019yx06009

文章编号：1008-1534（2019）06-0422-07

Abstract：In order to study the quality control method of Crataegi fructus formula granules， the standard decoction of Crata-egi fructus is taken as the research object，the GL science C18（4.6 mm×250 mm， 5.0 μm） chromatograms column are used. Acetonitrile-0.4% phosphoric acid is mobile phase， the column temperature is 30 ℃， the flow rate is 1.0 mL/min， and the detection wavelength is 254 nm. The characteristic components in the characteristic of the standard decoction of Crataegi fructus are extracted by using characteristic atlas technology and similarity evaluation software of traditional Chinese medicine fingerprint. The results show that there are 7 characteristic peaks in 15 batches of Crataegi fructus standard decoction. The separation degree is good， and the peak area is large and easy to identify. Three characteristic peaks are calibrated with reference substance. RSD value of relative retention time of each common peak is less than 2.5%. The established characteristic chromatographic method of Crataegi fructus standard decoction is reliable and stable， which provides a reference for the quality control of Crataegi fructus formula granules.

Keywords：chemistry of Chinese material medica; the standard dection of Crataegi fructurs; feature chromatograms; chlorogenic acid; hypericin; isoquercetin

山楂為蔷薇科植物山里红Cralaegus pinnatifida.Bge.var.major N.E.Br.或山楂Crataegus pinnatifida Bge.的干燥成熟果[1]。山楂中含有多种黄酮类成分，如牡荆素鼠李糖苷、槲皮素、金丝桃苷、槲皮素-3-O-β-D-6-乙酰基吡喃葡萄糖苷、槲皮素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷及槲皮素-3-O-β-D-6-乙酰基吡喃阿洛糖苷;还含有枸橼酸、牡荆素、熊果酸、绿原酸等有机酸类[2-3]。山楂为常用中药，临床应用广泛。现代药理学研究表明，山楂具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、降血压等功效，山楂中的总黄酮对动物心肌缺血具有治疗作用，所含的有机酸具有促进消化等功效[4-5]。

已有研究表明，使用HPLC建立指纹图谱方法可用于对不同植物来源山楂药材的鉴别[6-7]。彭灿等[8]采用乙腈-冰乙酸缓冲溶液，对山楂中的有机酸类成分进行了指纹图谱分析，建立的指纹图谱方法符合相关要求;邹录惠等[9]利用固相萃取SPE技术，结合HPLC指纹图谱方法，对山楂药材中的总黄酮类成分进行分析，确定了10个共有峰成分，并指认了4个共有峰;李晓亮等[10]对不同产地的山楂叶进行了指纹图谱分析，发现山西晋城山楂叶的色谱峰较多。目前，未见山楂标准汤剂特征图谱的相关文献。本文以由不同产地山楂饮片制备而成的标准汤剂为研究对象，通过建立特征图谱方法，对不同产地的山楂标准汤剂进行分析，以期为山楂配方颗粒的质量控制提供参考。

1 主要仪器与试剂

1.1 仪器

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，日本岛津株式会社提供;GL science C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm）;CP225D型电子分析天平，赛多利斯公司提供;KH3200E型超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司提供;电加热套，北京科伟永兴仪器有限公司提供;真空旋转蒸发仪，上海申科生物技术有限公司提供;LGJ-12压盖型真空冷冻干燥机，河南兄弟仪器设备有限公司提供;圆底烧瓶，量筒，烧杯。

1.2 试剂

绿原酸对照品，批号为110737-201516，购自中国药品生物制品检定所;金丝桃苷对照品，批号为111521-201005，购自中国药品生物制品检定所;异槲皮苷对照品，批号为111809-201105，购自中国药品生物制品检定所;磷酸，分析纯，批号为20170309，天津市科密欧化学试剂有限公司提供;甲醇，色谱纯，批号为20170313，天津市科密欧化学试剂有限公司提供;乙腈，色谱纯，批号为20171213，天津市科密欧化学试剂有限公司提供;水为自制纯化水。

1.3 15批山楂标准汤剂的制备

1.3.1 山楂饮片来源

15批山楂饮片采购于山西、河北、山东产地的市场，经企业质控中心检验，15批饮片均符合《中华人民共和国药典》2015版“山楂”项下的相关要求[1]。详见表1。

1.3.2 山楂标准汤剂制备方法

分别取15批山楂饮片约100.0 g，除去可见异物（石头、尘土等），转移至圆底烧瓶中，加入饮片量8倍的水，浸泡30 min。大火加热至沸腾，改小火煎煮30 min，过0.074 mm滤网，将滤液快速冷却。在药渣中加入饮片量6倍的水，大火加热至沸腾，改小火煎煮20 min，过0.074 mm滤网，将滤液快速冷却。合并2次煎液。将提取液用旋转蒸发仪于60 ℃浓缩，浓缩至生药量与浓缩液体积比约为1∶3时为宜。将浓缩液使用冷冻干燥机干燥。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

岛津LC-20AT高效液相色谱仪，色谱柱为 GL science C18（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），流速为1.0 mL/min，柱温为30 ℃，检测波长为254 nm，进样量为10 μL，流动相为乙腈（A）-0.4%磷酸（B）。梯度洗脱程序见表2。

2.2 对照品溶液的制备

取绿原酸、金丝桃苷、异槲皮苷对照品，精密称定4，4.5，2 mg，转移至50 mL容量瓶中。加入50%（体积分数，下同）的甲醇制成每1 mL含80 μg的绿原酸溶液，加甲醇制成每1 mL含90 μg的金丝桃苷溶液，加甲醇制成每1 mL含40 μg的异槲皮苷溶液，作为对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

取标准汤剂0.40 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中。精密加入70%甲醇25 mL，超声处理（功率为250 W，频率为40 kHz）30 min，再称定质量，用70%甲醇补足减失的质量，摇匀，过滤，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度考察

取山楂标准汤剂样品（S9）0.40 g，按供试品溶液制备项下所述方法制备供试品溶液，依照“2.1”项所述色谱条件，连续进样测定5次。将所得色谱图导入2008版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，并以共有色谱峰5为参照，计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值。特征峰相对保留时间的RSD值为0.00%～0.27%，相对峰面积的RSD值为0.00%～2.35%，均小于5.00%。说明该仪器的精密度符合分析方法的要求，详见表3和表4。

2.4.2 重复性考察

取山楂标准汤剂（S9）0.40 g，按供试品溶液制备所述方法，平行制备5个样品溶液，依照“2.1”项所述色谱条件进行测定。将所得色谱图导入2008版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，以共有色谱峰5为参照，计算各特征峰的相对保留时间与相对峰面积的RSD值。特征峰相对保留时间的RSD值为0.00%～0.86%，相对峰面积的RSD值为0.00%～3.05%，均小于5.00%，说明该方法的重复性符合分析方法要求，详见表5和表6。

2.4.3 稳定性考察

取山楂标准汤剂（S9）0.40 g，按供试品溶液制备所述方法，制备样品溶液，依照“2.1”项所述色谱条件，对同一样品溶液分别于0，2，4，6，8 h测定。将所得色谱图导入2008版《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》，并以色谱峰5为参照，计算各特征峰相对保留时间与相对峰面积的RSD值。特征峰相对保留时间的RSD值为0.00%～0.89%，相对峰面积的RSD值为0.00%～2.95%，均小于5.00%，说明样品在8 h以内测定，稳定性符合分析方法的要求。详见表7和表8。

2.5 15批山楂标准汤剂特征图谱的测定

对15批山楂标准汤剂按照“2.1”项所述色谱条件进行样品处理及测定，结果见图1。通过对15批山楂标准汤剂特征图谱进行分析，确定了7个特征峰。通过查阅相关文献[8-9]，并与标准品保留时间及紫外最大吸收比对，指认了7个特征峰中的3个成分：5号峰为绿原酸，6号峰为金丝桃苷，7号峰为异槲皮苷。详见图2。

2.6 数据分析

采用《中药色譜指纹图谱和相似度评价系统》，选取时间窗宽度为0.1 min，以中位数生成对照色谱图，经过多点校正后自动匹配，生成山楂标准汤剂HPLC特征图谱对照图谱。15批山楂标准汤剂7个特征峰中5号特征峰（绿原酸）峰面积稳定，分离度良好，故选其作为参比峰。各共有峰的相对保留时间（RRT）和相对峰面积（RPA）分别见表9和表10。

各共有峰相对保留时间的RSD值小于2.5%，说明各产地山楂的化学成分差异较小;相对峰面积的RSD值较大，范围为0.00%～44.38%，说明不同产地山楂标准汤剂所含化学成分的相对含量相差较大。

15批山楂标准汤剂中共有7个特征峰，分离度较好，且峰面积较大，易于识别。因此，以上述7个共有峰作为特征峰，以5号共有峰作为S峰，相对保留时间值±8%为控制范围，规定值如下：0.27（峰1）、0.50（峰2）、0.55（峰3）、0.59（峰4）、1.00（峰S）、1.45（峰6）、1.47（峰7）。

3 讨 论

3.1 色谱条件的考察

通过实验分别考察了乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.4%磷酸3個流动相体系[11]。结果表明，采用乙腈-0.4%磷酸时，特征图谱中的主要色谱峰分离较好，基线波动小，因此，确定采用乙腈-0.4%磷酸作为流动相。

3.2 提取溶剂的比较

通过对50%，70%甲醇水与100%甲醇进行比较，发现以70%甲醇提取的样品中色谱峰的个数较多，峰形较好，故选择70%甲醇作为提取溶剂。对比超声与回流提取方式，两种处理方式色谱峰的数量、峰面积差异较小，而超声提取法简便、快捷，因此选用超声提取方法。

3.3 山楂标准汤剂成分考察

考察了山楂标准汤剂中所含的有机酸、黄酮两类成分。有机酸以绿原酸为代表，黄酮类成分以金丝桃苷、异槲皮苷为代表。由于芦丁成分在山楂标准汤剂中的含量较低，响应值较弱，故未检测到该成分。而在相关文献中，可从山楂饮片中检测出芦丁成分[9]，说明山楂标准汤剂与山楂饮片在成分种类方面有一定的差异。河北产地的山楂中，S5样品中的3号特征峰相对峰面积低于15批样品的平均相对峰面积值，而相同产地S4和S6样品3号特征峰的相对峰面积高于15批样品的平均相对峰面积值，说明产地因素对山楂标准汤剂中的特征峰相对峰面积有较大的影响。但7个特征峰为15批山楂标准汤剂样品共有，说明产地因素对特征峰种类的影响较小。故只应以7个特征峰的相对保留时间为规定值，根据相对峰面积无法制定出合理的规定值范围。

4 结 语

1）2015版《中华人民共和国药典》中规定，山楂饮片含量测定时以枸橼酸为指标，采用的是酸碱滴定法。通过查阅文献可知，枸橼酸极性较大，在反相色谱中的保留值较弱[12]，故将山楂标准汤剂特征图谱初始梯度设置为φ（乙腈）∶φ（0.4%磷酸）=5∶95。但该成分在特征图谱中仍无保留行为，存在于特征图谱前5 min的色谱峰群中。而山楂标准汤剂中绿原酸有较好的保留行为，且含量适中，故选取绿原酸峰作为特征图谱的参比峰，同时，标定山楂标准汤剂中的黄酮类成分[13]。

2）山楂标准汤剂是以不同产地的山楂饮片为原料，经提取、浓缩、干燥制备而成。通过HPLC特征图谱分析[14-15]可知，3个主产地的15批山楂样品的峰个数差异较小，7个特征峰均出现在15批样品中，但峰面积差异较大，相对峰面积的RSD值为0.00%～44.38%。

3）本研究的特征图谱中只对3个特征峰进行了指认，其余特征峰还需进一步应用质谱等仪器进行分析，这也是今后需要加以改进的方面。

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