吴明生 赵海艳 彭瑞迪 律宝春

摘   要：基于毛细管电泳技术，利用24对多态性SSR标记引物构建了13个北京地区主栽西瓜品种标准样品DNA指纹，并通过北京市农作物品种标准样品信息管理系统实现指纹信息的共享和应用，为这些西瓜品种的鉴定和品种权保护提供了技术支撑，并为规范北京西瓜产业发展保驾护航。

关键词：西瓜;主栽品种;标准样品;SSR标记;指纹构建;应用

西瓜作为北京市优势经济作物，在京郊农业生产中发挥着重要作用。但是近年来，西瓜品种“多、乱、杂”现象日趋严重，优良品种套牌侵权行为时有发生，不仅扰乱了种业市场，危及农业生产，也打击了育种者的积极性，并影响着种子产业健康发展。

1   材料与方法

1.1   试验材料

供试的13个西瓜品种均为北京地区主要栽培品种，包括京秀、航兴1号、航兴3号、北农天骄2号、暑宝6号、京欣1号、京欣2号、京欣3号、京欣无籽1号、红小帅、黄小玉、黑美人和黑晶，所有品种的标准样品种子由北京市农作物品种标准样品库提供。

1.2   试验方法

1.2.1   DNA提取

每份试验材料取50粒种子混合研磨，之后从其中取100 mg粉末置于1.5 mL离心管中，采用新型植物基因组DNA提取试剂盒（TIANGEN，北京）提取西瓜基因组DNA。

1.2.2   SSR引物设计

24对西瓜多态性SSR标记引物参照吴明生等[1]，所有引物采用荧光标记，由美国应用生物系统公司合成，引物信息见表1。

1.2.3   PCR扩增

PCR反应体系为：1×Taq Buffer，MgCl2 2.5 mol/L，dNTPs 0.15 mol/L每种，引物0.25 μmol/L每种，Taq 聚合酶0.1 U，DNA模板50 ng，总体积20 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性5 min、94 ℃变性30 s、58 ℃退火35 s、72 ℃延伸45 s，共36个循环，72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.2.4   电泳与数据分析

通过毛细管电泳仪（ABI 3500XL）对PCR产物进行电泳，分子量内标为Liz600，利用ABI GeneMapper 5.0软件对采集的原始数据进行片段分析。

1.2.5   遗传聚类分析

SSR扩增分离结果采用0、1统计方法，在同一分子量上，“有带”记为1，“无带”记为0。通过NTSYS-pc

Version 2.0软件，按照非加权配对算数平均法（UPGMA）完成遗传聚类。

2   结果与分析

2.1   引物分组及多重电泳

为了提高指纹数据采集的效率，采用8重毛细管电泳技术，即将24对引物分成3组，8对引物为一组（即引物Panel），采用四色荧光（FAM、VIC、PET、NED）对引物进行标记，确保同一组中的相同荧光标记的引物之间扩增片段大小区间不重叠（表1），这样就可以将每组引物扩增的产物混合在一起电泳。同时通过Gene Mapper软件对每对引物的等位基因进行命名，设置每个等位基因读值区间（即Bin，结果未显示），利用Gene Mapper软件对采集的原始指纹数据进行快速分析，自动确定每个位点的基因型。

2.2   标准样品指纹采集

标准样品指纹采集通过双人比对的方式，即两人分别取50粒种子，样品粉碎、DNA提取、PCR扩增、电泳及指纹信息读取都单独进行。当两人采集的指纹信息比对完全一致的，则直接记录为该品种的指纹信息;对于不一致的指纹信息，需要查找原因，进行再次测试确认，直到结果一致。13个西瓜品种最终采集指纹数据信息是312个（图1），采集成功率100%，其中一次测试就确认的信息282个，占比90.4%;再次测试确认的30个，占比9.6%，主要集中在P4号引物和P23号引物，共计18个，占再次确认的60%。

2.3   品种近似性分析

根据“0、1”规则，利用采集的指纹信息，通过NTSYS-pc Version 2.0软件对13个品种進行遗传聚类和近似性分析（图2），结果显示京欣2号和京欣无籽1号最为近似，近似系数达到0.97，差异2个位点，其余品种间差异位点都在6个以上，说明北京主栽西瓜品种间的遗传背景较为广泛，具有较好的多样性。

2.4   指纹信息共享应用

为了推进标准样品指纹信息的共享应用，将所有品种的指纹数据及峰型图录入北京市农作物品种标准样品信息管理系统（软件证书登记号：3442753），用户可以利用系统查询相关品种的指纹信息，并可以将自己所做样品的指纹信息与系统里的标准样品指纹信息进行比对，以此分析样品的真伪，从而为品种鉴定和品种权保护提供技术支撑。

3   讨论

DNA标记指纹技术在玉米、水稻等主要农作物品种鉴定上得到广泛应用[2-4]，为其品种权保护提供了重要的技术保障，有效遏制了品种权侵权、假冒违法行为。然而像西瓜、番茄、辣椒等非主要农作物，指纹鉴定技术研究相对较少，目前也没有权威已知品种指纹数据库，品种鉴定更多的还是依赖于田间种植鉴定，不仅费时费力，而且时效性差。

在没有相关成熟技术标准的条件下，为更好地开展北京市优良西瓜品种快速鉴定与品种权保护工作，本研究在前期引物筛选的基础上，利用征集的标准样品构建了北京市主要栽培西瓜品种的SSR指纹，并通过网络平台实现指纹信息的共享和比对，为西瓜品种真实性快速鉴定提供了重要的辅助作用。下一步将根据品种推广的情况，采集更多优良西瓜品种的指纹信息，同时将指纹鉴定结果与田间种植鉴定结果进行比较，对标记引物进一步优化，提高品种鉴定的准确性。

参考文献：

[ 1 ] 吴明生，牛茜，田雅栏.西瓜品种SSR标记鉴定引物的筛选与分析[J].作物杂志，2014（5）：38-42.

[ 2 ] 王凤格，杨扬，易红梅，等.中国玉米审定品种标准SSR指纹库的构建[J].中国农业科学，2017，50（1）：1-14.

[ 3 ] 陆徐忠，倪金龙，李莉，等.利用SSR分子指纹和商品信息构建水稻品种身份证[J].作物学报，2014（5）：823-829.

[ 4 ] 匡猛，杨伟华，许红霞.中国棉花主栽品种DNA指纹图谱构建及SSR标记遗传多样性分析[J].中国农业科学，2011，44（1）：20-27.

（收稿日期：2019-08-14）