丁华杰　叶云　高强　钟英英

摘    要：为了研究白藜芦醇抗乳腺癌的作用机制，从GEO数据库获取用白藜芦醇处理过的乳腺癌的表达谱数据集（GSE25412），通过BRB软件包获取差异表达基因;对差异基因进行功能聚类和蛋白-蛋白相互作用分析，GSEA对乳腺癌进行基因集富集分析;最后通过CMAP对药物作用机制或药理作用进行预测.结果：通过对比白藜芦醇和乙醇作用于MCF7细胞基因表达谱 ，获得763个显著差异基因，其中上调基因262个，下调基因501个;GSEA主要富集到细胞代谢等18条与乳腺癌相关的信号通路;蛋白相互作用网络的分析结果显示：IFI44可能成为药物作用新靶点.CMAP分析结果显示：白藜芦醇的抗乳腺癌作用机制复杂，分析结果显示与激素作用、HDAC抑制劑、hsp90抑制剂、PI3K抑制剂等有关.研究结果表明：基于基因表达谱的乳腺癌组织与正常组织的筛选比对，为抗肿瘤药物发现提供新思路，为后期的相关临床研究提供重要信息.

关键词：白藜芦醇;乳腺癌;基因表达谱;生物信息学

中图分类号：R737.9                  DOI：10.16375/j.cnki.cn45-1395/t.2019.02.012

0    引言

白藜芦醇（Resveratrol）来源较广泛，可以直接从葡萄、草莓、花生等植物中提取[1].近年来，白藜芦醇抗肿瘤活性的研究日趋白热化，成为研究者关注的重点.现有的研究表明，白藜芦醇具有显著的抑制肿瘤细胞增殖作用，尤其对于肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌等常见肿瘤[2-3].然而，肿瘤发生发展的生物学过程是十分复杂且多样性的，目前对于白藜芦醇的抗癌机理还不够明确.

基因芯片和生物信息学分析可以从全基因组探讨白藜芦醇抗乳腺癌的作用机理.近10年来，基因表达谱芯片在肿瘤研究中得到广泛应用，是探索体内肿瘤细胞发生发展过程中基因表达谱变化的强有力的工具.尤其是在探索肿瘤发生发展机制、作用机理、肿瘤基因分型、指导治疗、评估预后等领域有重要价值[4-7].本研究利用基因芯片高通量的优点，对白藜芦醇处理和对照的乳腺癌细胞进行基因表达谱比较分析，深入分析潜在的作用机制，为研究白藜芦醇治疗乳腺癌作用提供可参考的理论依据[8].

1    材料与方法

1.1 GEO数据集的获取

本研究采用的白藜芦醇抗乳腺癌表达谱数据（GSE25412）是从Pubmed的GEO数据库（http：www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）中获取.该数据集采用Affymetrix公司的Human Gene 1.0 STArray芯片平台，包括9个基因表达谱数据，用乙醇处理过的3个对照样本以及白藜芦醇处理过的6个实验样本.用来研究的生物样本为：用两种浓度（150和250 μmol/L）的白藜芦醇（实验组）或（150和250 μmol/L）乙醇处理（对照组）48 h的MCF7细胞系.

1.2 差异表达基因的筛选

对实验数据进行归一化处理，对处理过的数据采用BRB-ArrayTools软件包进行差异基因的分析.BRB-ArrayTools可以被用来分析多种通道的基因芯片数据，具体使用方法可从网站http：//linus.nci.nih.gov/BRB-ArrayTools/获得[9]，其中筛选条件为：FDR=10%、可信度95%、permutation为1 000次、2-fold change.

1.3 GSEA信号通路富集分析

从GSEA网站MsigDB数据库中，共获得310个与生物信号传导相关的基因集作为参考基因集.每次分析重复1 000次，标准化的P<0.05的基因集定义为阳性基因集[10].

1.4 生物功能聚类分析

GO注释收集了来源于Gene ontology和NCBI（www.ncbi.nih.gov/gene/data/GO（Gene ontology））数据库的信息.对获取的差异表达基因进行GO功能富集分析，以此来表述白藜芦醇抗乳腺癌的作用机制，为后续分析提供理论基础.

1.5   生物信号通路分析

采用DAVID（http：//david.Abcc.Ncifcrf.gov/）数据库对获取的上、下调差异基因进行对比.了解这些差异基因的生物学功能;利用KEGG数据库找到与这些基因对应的通路，进一步分析白藜芦醇抗乳腺癌作用机制.

1.6   蛋白相互作用网络分析

将上述分析结果得出的上、下调差异基因在STRING（http：//www.string- db.org/）数据库中进行比对，得到蛋白-蛋白相互作用网络.进一步获得核心基因.

1.7   CMAP筛选乳腺癌治疗药物

Connectivity map（CMAP）数据库可以探索疾病及其相关基因的联系，挑选出靶向作用于基因的药物.为了进一步探讨白藜芦醇抗乳腺癌作用机制，将上述获得的差异上调、下调基因分别导入CMAP数据库中，按CMAP使用说明操作，进行药物[11-12]筛选分析.

2    结果与分析

2.1   基因芯片数据预处理

对芯片数据压缩后，将数据导入BRBArrayTools软件包，并自动生成试验文件.对数据进行标准化处理，标准化处理前后的结果如图1所示.

2.2   差异表达基因筛选的结果

通过对比白藜芦醇和乙醇分别作用于MCF7细胞系的表达谱变化，共筛选出763个显著差异基因，其中上调基因262个，下调基因501个.

2.3   GSEA信号通路富集分析结果

采用GSEA对所获取的差异表达数据进行富集分析，发掘与乳腺癌发生发展有关系的作用机制，获取有密切联系的基因及信号通路，详细结果见表1、图2.结果显示：主要包括细胞代谢、细胞周期调控、细胞运动、物质代谢等18条生物信号通路与乳腺癌的发生机制有着密切关系.

2.4   功能聚类分析

本研究对作用于白藜芦醇MCF7细胞的差异显著基因进行信号通路分析：在下调基因中，并未获得具有统计学意义的信号通路;在上调基因中，通过GO分析，主要涉及负调控凋亡过程、调节细胞增殖、细胞增殖、对药物的反应、凋亡过程等（见图3）.

2.5   信号通路分析

通过KEGG分析，在上调基因中，主要涉及p53信号通路、TNF信号通路、破骨细胞分化、PK信号传导途径（如图4所示）.

2.6    候选基因蛋白产物相互作用分析

在蛋白互作分析网络中，选出了IFI44、KNTC1、HIST1H2AB、CDCA2、PSMC3IP、KLHL5、ATAD5、PGR这8个节点度最高的基因，即为核心基因.

2.7   CMAP分析结果

本研究采用CMAP数据库从基因层面上发掘白藜芦醇抗乳腺癌作用机制，与数据库中现存药物进行比对，筛选出功能最为相似的药物.将乳腺癌差异表达基因与CMAP数据库中药物表达谱进行对比，在药物筛选中，首先过滤掉检测次数<5、P<0.05的药物，结合Enrichment及P值两项参数，获得了白藜芦醇与伏立诺他、15δ前列腺素J2、LY-294002、坦螺旋霉素、西罗莫司等13种抗癌药物表达谱的变化相似，表明了白藜芦醇抗癌作用主要与激素、抗炎、抗菌等作用有关（见表2）.

3    讨论

本研究通过发掘基因图谱数据库，并对比白藜芦醇和乙醇分别作用于MCF7细胞系和正常细胞系的表达谱变化，总共获得差异基因数量763个.其中上调基因262个，下调基因501个.基因生物过程分析结果显示，白藜芦醇主要通过正向调控凋亡过程、细胞增殖、调节细胞增殖、对药物的反应等过程的基因进而发挥抗乳腺癌作用.

肿瘤发生发展机制过程中的一个重要特征是信号传导通路的紊乱或异常.为了揭示乳腺癌发生发展过程中主要存在的差异表达异常通路，采用GSEA对所获取的表达谱数据进行通路富集分析.结果发现与乳腺癌发生发展有着密切关系的信号通路主要有：细胞代谢、细胞周期调控、细胞运动、物质代谢等      （表1），与现有的研究报道相似[13-14].在随后的CMAP分析中，筛选到的药物与GSEA的分析结果相吻合：如伏立诺他、HDAC抑制剂如曲古抑菌素A可以诱导细胞分化和（或）凋亡，hsp90抑制剂如坦螺旋霉素、格尔德霉素可干扰细胞周期，秋水仙碱可抑制有丝分裂，破坏纺锤体，使染色体停滞在分裂中期.也有实验表明[15]，秋水仙碱可用于靶向治疗乳腺癌，白藜芦醇可以通过参与miRNA过客链的降解、代谢，进而降低乳腺癌干细胞的数量，并且现有实验表明[16]，白藜芦醇有很大潜力作为一种靶点药物来治疗乳腺癌.基于上述分析，认为本研究所采用的基于基因表达谱筛选药物的模式是可行的，可以有效地筛选到一些治疗乳腺癌的候选药物，为肿瘤治疗提供一定的理论依据.

本研究发现，白藜芦醇主要通过PIK3、p53、破骨细胞分化、TNF（肿瘤坏死因子）、溶酶体、HTLV-I感染等信号通路中的相关基因发挥抗癌作用.通过对乳腺癌患者组织基因芯片与正常组织基因芯片进行分析，结果显示差异表达的基因主要富集于细胞周期和DNA复制等信号通路中.在蛋白互作分析网络中（如图5所示），筛选出IFI44、KNTC1、HIST1H2AB、CDCA2、PSMC3IP、KLHL5、ATAD5、PGR这8个关键基因，其中干扰素诱导基因IFI44具有较高的表达，也提示癌细胞中的DNA复制明显异于正常细胞.Nikolai等[17]的研究表明，IFI44等19种基因是干扰素诱导路径的成分，其中IFI44等极有可能参与了对射线的抵抗，而化疗又是当今比较普遍的癌症治疗手段之一.由此可以推断，进一步探讨乳腺癌关键基因IFI44的调控机制显得尤为重要，为后续的乳腺癌和其他癌症治疗提供帮助.

为了进一步探讨白藜芦醇抗乳腺癌作用机制，采用了CMAP对药物进行预测分析，筛选到伏立诺他、曲古抑菌素A、15δ前列腺素J2、LY-294002、坦螺旋霉素、西罗莫司、格尔德霉素等13种候选药物与白藜芦醇处理乳腺癌的表达谱相似，这些候选药物主要归类于HDAC抑制剂、植物抗毒素、PPAR受体激动剂、抗真菌和免疫抑制剂、PI3K抑制剂、hsp90抑制剂和抗肿瘤药等.CMAP表达谱结果显示，白藜芦醇抗乳腺癌表达的富集分数较高，在抗乳腺癌方面具有较好的表达，更进一步说明白藜芦醇具有较好的抗乳腺癌作用.结果中发现，西罗莫司作为一种新型的免疫抑制剂也出现在表达谱结果中.现今关于西罗莫司在抗癌，尤其是抗乳腺癌方面研究较少，主要用于临床上的器官移植的抗排斥反应和自身免疫性疾病的治疗.西罗莫司有望在治疗乳腺癌方面起到一定的作用，成为治疗乳腺癌的候选药物，为后期的研究提供一定的参考.

传统的治疗方法如化疗、放疗等对机体正常细胞都有或多或少的损伤，因而不能在临床上大剂量的应用.体内外研究证明[18-20]，白藜芦醇的抗乳腺癌机制是多通路、多靶点的，相比传统化学治疗药，具有来源广泛、抗癌谱广、毒副反应小等优点[21].因此，基于白藜芦醇的功效，开发出一种新型的抗乳腺癌的藥物，且作为一种天然中草药提取物，具有一定的开发前景.目前虽然对白藜芦醇抗肿瘤机制的研究很多，但作为抗肿瘤药应用于临床仍需进一步的研究证实.

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Analysis of gene expression pathway in breast cancer cells treated with resveratrol

DING Huajie， YE Yun， GAO Qiang， ZHONG Yingying*

（School of Biological and Chemical Engineering， Guangxi University of Science and Technology，

Liuzhou 545006， China）

Abstract： Based on gene expression profile data， breast cancer related genes and signaling pathways， as well as resveratrol anti-breast cancer mechanism， the expression profile data set （GSE25412） of breast cancer treated with resveratrol was obtained from the GEO database. Differentially expressed genes were obtained by BRB software package; functional clustering and protein-protein interaction analysis of differential genes and GSEA Gene set enrichment analysis of breast cancer were made;       finally， the mechanism of action or pharmacological action of the drug was predicted by CMAP. By comparing the gene expression profiles of resveratrol and ethanol in MCF7 cells， 763 significant        differential genes， 262 up-regulated genes and 501 down-regulated genes were obtained. GSEA was mainly enriched with 18 breast cancer-related signals. Analysis of protein interaction network shows that IFI44 may become a new target for drug action. The results of CMAP analysis showed that the    anti-breast cancer mechanism of resveratrol was complicated， and the results showed that it was related to hormone action， HDAC inhibitor， hsp90 inhibitor and PI3K inhibitor. Therefore， screening of breast cancer tissue and normal tissue based on gene expression profile provides new ideas for anti-tumor drug discovery and gives important information for later clinical research.

Key words： resveratrol; breast cancer; gene expression profile; bioinformatics