田方 孙福仁 张肖建 李雪利 耿彦梅 高晗 李军山

摘要：为全面反映合欢皮标准汤剂多种组分的面貌，明确合欢皮标准汤剂的HPLC指纹图谱，对15批合欢皮标准汤剂进行了HPLC指纹图谱测定及相似度评价。采用HPLC方法，色谱柱为WatersSymmetryshieldRPC18柱（4.6mm×250mm，5μm），以乙腈-0.04%磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，检测波长为210nm，流速为1mL/min，柱温为25℃，对照指纹图谱对合欢皮标准汤剂进行相似度评价及聚类分析。结果表明，15批合欢皮标准汤剂指纹图谱中呈现10个共有峰，相似度为0.967～0.998，表明合欢皮标准汤剂具有良好的一致性;此外，在10个共有峰中指认出（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、异槲皮苷2个化学成分。因此，合欢皮标准汤剂指纹图谱反映了合欢皮标准汤剂的多组分面貌，具有良好的可行性，可为合欢皮配方颗粒的多组分质量控制提供参考。

关键词：中药化学;合欢皮;标准汤剂;HPLC指纹图谱;相似度;聚类分析

中图分类号：R917文献标志码：A

文章编号：1008-1534（2019）02-0128-07

合欢皮，别名合昏皮（《备急千金要方》）、夜合皮（《独行方》）、合欢木皮（《本草纲目》）[1]，为豆科植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥树皮，经夏、秋两季剥取后晒干而得，具有解郁安神、活血消肿的功效，临床上用于心神不安、忧郁失眠、肺痈、疮肿、跌扑伤痛等症的治疗[2]。中药饮片标准汤剂是指在中医药理论指导下，选取道地药材或主产区药材，将其加工炮制成合格饮片后，经标准化工艺制备而成的中药饮片水煎剂型[3-4]。中药饮片标准汤剂研究为配方颗粒的质量研究奠定了基础。

目前，关于合欢皮标准汤剂质量研究的报道很少，相关指纹图谱的研究尚未见报道。合欢皮相关药材的报道多集中于对其化学物质种类[5-9]、药理作用[10-12]的研究，对于其指纹图谱虽有研究，但部分色谱峰并未达到基线分离，分离效果也有待提高[13-14]。2015年版《中华人民共和国药典》对于合欢皮词条仅收录了合欢皮药材和饮片单一化学成分的含量测定方法。中药材成分复杂，一种化学成分指标往往并不能代表药材的整体质量情况。合欢皮含有三萜、黄酮、木脂素、生物碱、鞣质及多糖等多种化学成分，成分较为复杂，且水溶性木脂素类化合物的结构较为相似，这些都为指纹图谱方法的制定带来了一定的困难。本研究通过建立合欢皮标准汤剂的HPLC指纹图谱，全面反映合欢皮标准汤剂多种组分的面貌，以期为合欢皮配方颗粒的质量控制提供参考。

1主要仪器与材料

日本岛津公司高效液相色谱仪（LC-20AT型泵），真空冷冻干燥机（Tofflon）），CPA225D分析天平（Sartorius），AE240电子分析天平（瑞士Mettler-Toledo有限公司提供），KH3200E型超声波清洗器（江苏昆山禾创超声仪器有限公司提供）。

对照品（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，批号为111911-201603，中国食品药品检定研究院提供;对照品异槲皮苷，批号为111809-201403，中国食品药品检定研究院提供;色谱纯乙腈，批号为20180713，天津科密欧化学试剂有限公司提供;分析纯甲醇，批号为20180611，北京益利精细化学品有限公司提供;15批合欢皮饮片，经原河北省药品检验研究院孙宝惠主任鉴定为豆科植物合欢AlbiziajulibrissinDurazz.的干燥树皮，水分、浸出物、（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷等指標均符合2015年版《中华人民共和国药典》要求。饮片来源及标准汤剂编号见表1。

2方法与结果

2.1指纹图谱方法建立

2.1.1色谱条件

色谱柱为WatersSymmetryshieldRPC18（4.6mm×250mm，5μm）;流动相为乙腈-0.04%（体积分数，下同）磷酸溶液，按照表2所示比例进行梯度洗脱。检测波长为210nm，柱温为25℃，流速为1mL/min，进样量为10μL。

2.1.2对照品溶液的制备

取（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含25μg的溶液。另取异槲皮苷对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含异槲皮苷10μg的溶液。

2.1.3供试品溶液的制备

取冻干膏粉适量，研细，取0.2g，精密称定，置入具塞锥形瓶中，精密加入50%甲醇25mL，称定质量，超声（功率250W，频率40kHz）30min，放冷，再称定质量，用50%甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.4方法学考察

1）精密度试验

取合欢皮标准汤剂（编号S10），按照“2.1.3”项所述方法制备供试品溶液。精密吸取10μL，连续进样6次，各共有峰相对保留时间的RSD值<0.7%，相对峰面积的RSD值<1.7%，表明仪器精密度良好，详见表3和表4。

2）重复性试验

取合欢皮标准汤剂（编号S10），按“2.1.3”项所述方法分别制备6份供试品溶液，平行测定，各共有峰相对保留时间的RSD值<0.7%，相对峰面积的RSD值<3.2%，表明方法的重复性良好，详见表5和表6。

3）稳定性试验

取同一供试品（编号S10）溶液，分别在0，2，5，8，12，16，21h进样测定，各共有峰相对保留时间的RSD值<0.8%，相对峰面积RSD值<2.3%，表明供试品溶液在0～21h稳定，详见表7和表8。

2.2指纹图谱的分析

2.2.115批合欢皮标准汤剂制备

取合欢皮饮片100g，第1次加10倍水，浸泡30min，煎煮30min，过滤;第2次加8倍水，煎煮20min，过滤。合并2次水煎液，经真空低温浓缩、冷冻干燥后得到膏粉，即得合欢皮标准汤剂。

2.2.2对照图谱的建立及色谱峰指认

精密吸取对照品溶液，按“2.1.1”项色谱条件进行分析，得到对照品HPLC色谱图。精密称定

15批合欢皮标准汤剂样品，按“2.1.3”项所述方法制备供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件进行分析，得到合欢皮标准汤剂指纹图谱，见图1。

通过与（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、异槲皮苷对照品图谱比对，确认合欢皮标准汤剂指纹图谱中7号峰为（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷，9号峰为异槲皮苷。

2.2.3样品测定

照“2.1”项所述方法制备对照品溶液及供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与15批合欢皮标准汤剂供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪，测定，记录色谱图，见图2。

从15批合欢皮标准汤剂HPLC指纹图谱可以看出，合欢皮标准汤剂的出峰时段较长，呈现的峰数目较多，表明合欢皮标准汤剂化学成分较为复杂。比较15批合欢皮标准汤剂HPLC指纹图谱测定结果可以发现，不同合欢皮标准汤剂样品呈现的指纹图谱无明显差异，15批合欢皮标准汤剂中10个共有峰相对保留时间的RSD值为0.00%～1.09%，表明不同产地的合欢皮饮片制成的标准汤剂具有类似的化学成分，但S1—S10相对峰面积的RSD值为0.00%～60.78%，差异均较显著，表明合欢皮标准汤剂化学成分含量存在显著差异，初步分析可能和不同产地饮片间化学成分的含量差异和标准汤剂制备过程中化学成分的转移有关。

2.2.4相似度分析

采用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件”（2012版），分别对15批合欢皮标准汤剂指纹图谱进行相似度评价，结果见表9。

由表9可以看出，15批合欢皮标准汤剂指纹图谱整体相似度为0.967～0.998，表明15批合欢皮标准汤剂具有良好的一致性。

2.2.5聚类分析

将15批合欢皮标准汤剂相对共有峰峰面积导入SPSS19.0，进行聚类分析，分类依据为平均欧氏距离。结果见图3。

15批合欢皮标准汤剂被分为2大类，其中，湖北1、湖北2、湖北十堰、四川都江堰4个产地被分为第1大类，其余产地被分为第2大类。在第2大类中又分为4个小类，河南庐阳嵩县、湖北宜昌被分为单独2个小类，湖北3、陕西商洛、湖南永州、河南卢氏被分为一小类，其余产地为一类。从分类结果可知，湖北5个产地中，仅湖北1、湖北2、湖北十堰3个产地在分类上距离集中，其他2个产地在分类上距离较远。河南2个产地同样在分类上距离较远。15批合欢皮饮片在产地上具有代表性，指纹图谱能够反映出不同产地间的样品差异。

3结论

1）近来来，受国家政策的影响，中药配方颗粒因其方便快捷等特点受到越来越多人的关注[15-16]。中药饮片标准汤剂作为中药配方颗粒制备工艺及质量标准的研究基准，在国家出台的《中药配方颗粒质量控制与标准制定技术要求》（征求意见稿）中有明确的要求。而中药指纹图谱能最大限度获取有用化学信息，有效控制中药产品的质量[17]。

2）在《中华人民共和国药典》合欢皮含量测定的基础上，尝试了用甲醇-0.04%磷酸、乙腈-0.04%磷酸、乙腈-水、甲醇-水、乙腈-1%醋酸等不同流动相进行洗脱，并对洗脱梯度进行了优化，对不同柱温（25，30，35℃）、供试品的提取溶剂（50%甲醇、70%甲醇、甲醇、水）、超声时间（10，30，60min）和波长进行了筛选，通过优化最终得到了本研究的色谱条件。

3）采用高效液相色谱法，首次建立了合欢皮饮片标准汤剂指纹图谱，总出峰时段较长，呈现的峰数目众多，所得图谱基线较为平直，分离度较好，解决了合欢皮化学成分复杂、分离效果不理想的难题，并从中指认出（-）-丁香树脂酚-4-O-β-D-呋喃芹糖基-（1→2）-β-D-吡喃葡萄糖苷、异槲皮苷2个化学成分，方法具有良好的可行性，可为后续合欢皮配方颗粒多组分质量控制提供参考。由于出峰数目众多，其他峰的化学物质指认尚需进一步研究。

4）测定了15批标准汤剂指纹图谱，得出的相似度较高，说明合欢皮标准汤剂具有良好的一致性。通过对15批标准汤剂指纹图谱进行聚类分析，发现受不同产地的影响，合欢皮標准汤剂指纹图谱有所差异。这说明固定中药材产地对合欢皮标准汤剂的质量控制意义重大，也为后续研究提供了方向。

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