唐蕊 张雪辉 郑佳

摘   要： 以拮抗菌HM-7的光密度值为评价指标，采用单因素试验和正交试验，对培养基中的碳源、氮源、无机盐进行了优化，利用分光光度法确定最优培养基，旨在提高拮抗菌HM-7的产菌量，为进一步研究拮抗菌HM-7提供一定的依据和参考，同时为生物防治在生活中广泛应用奠定基础。结果表明，拮抗菌HM-7的最佳培养基配方为葡萄糖2 g、酵母膏8 g、NaCl 4 g、蒸馏水1 000 mL、pH7.0，在此条件下培养24 h，更利于菌体生长，为扩大培养拮抗菌HM-7打下了基础。

关键词： 拮抗菌; 培养基; 正交试验; 优化

Abstract：The optical density of the antagonistic bacteria HM-7 was used as evaluation index， the carbon source nitrogen source and inorganic salt in the medium were optimized by single factor experiment and orthogonal experiment， and the optimal conditions were determined by spectrophotometry. The aim of this study was to improve the yield and to provide a basis for the further study of antagonistic bacteria HM-7， meanwhile， it would lay the foundation for the extensive application of biological control in life. The results showed that the optimal medium of antagonistic bacteria HM-7 was glucose 2 g， yeast extract 8 g， NaCl 4 g， distilled water 1000 ml， pH 7.0， under these conditions， the growth of bacteria was much better than other formulas. Our results laid a foundation for expanding the culture of antagonistic bacteria HM-7.

Key words： Antagonistic bacteria; Culture medium; Orthogonal experiment; Optimization

近年來，环境问题显露，人们的环保意识增强，随着人类对化学防治和物理防治的质疑越来越多，促进农业发展、维护生态环境的生物防治逐渐深入人心，受到人类关注。生物防治主要包括以虫治虫、以菌治虫、以菌治菌3类，通过生物间竞争作用、抗生作用、寄生作用、溶菌作用及诱导抗性对植物体发挥作用，具有选择性强、无污染、兼防兼治保持生态平衡等优点[1] 。生物防治能够很快的深入人心，得到人民的普遍认可，完全取决于其对人体无害且能更好的防治病虫害，因此需要大力推进生物防治的发展，让生态环境越来越好，人民幸福感提升。自古代广东省利用黄柑蚁防治柑橘害虫后，国内外学者开始进一步研究生物防治，因此生物防治成为防治病虫害研究的一大热点[2]。唐蕊等[3]从土壤中分离出对黄瓜枯萎病有拮抗作用的拮抗菌HM-7，鉴定为生防芽孢杆菌中的解淀粉芽孢杆菌，其具有广泛的抑菌范围，能够抑制黄瓜等多种作物的病害，提高植物抗虫性和抗逆性，因此有着良好的发展前景。

笔者通过对拮抗菌HM-7培养基的优化，得到一个适合生长的培养基，给菌株提供良好的生活环境，提高产菌量。同时对拮抗菌HM-7的扩大培养和储存具有重要意义，为其以后应用于生物防治提供保障，也为生物防治能广泛的应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

菌种为邢台学院微生物实验室分离且保藏的拮抗菌HM-7，基础培养基为牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，蒸馏水1 000 mL，pH 7.0。

1.2 方法

1.2.1 原菌液的制备 将微生物实验室保存的拮抗菌HM-7活化2 h，转移至基础培养基中在37 ℃、120 r·min-1的条件下振荡培养24 h，得到拮抗菌HM-7的原菌液[4]。

1.2.2 单因素试验 碳源优化试验：分别选择葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、牛肉膏、可溶性淀粉作为碳源，保证基础培养基的其他组分一样。添加0.4%的碳源到未含碳源的基础培养基中，确保pH为7.0，以5%的接种量将原菌液接种到培养基中，在37 ℃，120 r·min-1的条件下培养24 h。用分光光度计测定600 nm处波长的光密度值，确定最佳碳源[5-6]。

氮源优化试验：分别选择蛋白胨、酵母膏、豆粕、氯化铵、尿素作为氮源，基础培养基中的其他组分不变。添加1.0%的氮源到未含氮源的基础培养基中，确保pH为7.0，以5%的接种量将原菌液接种到培养基中，在37 ℃，120 r·min-1的条件下培养24 h。用分光光度计测定600 nm处波长的光密度值，确定最佳氮源[5-6]。

无机盐优化试验：分别选择NaCl、 KCl、 K2HPO4、 KH2PO4、MgSO4 作为无机盐，基础培养基中的其他组分不变。添加0.5%的无机盐到未含无机盐的基础培养基中，确保pH为7.0，以5%的接种量将原菌液接种到培养基中，在37 ℃，120 r·min-1的条件下培养24 h。用分光光度计测定600 nm处波长的光密度值，确定最佳无机盐[5-6]。

1.2.3 正交试验 利用葡萄糖、酵母膏、NaCl 3个因素和不同添加量3个水平制成因素水平表1，采用L9（34）正交试验表来进行正交试验，测定其对拮抗菌HM-7生长的影响，最终得到最优培养基。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 碳源对拮抗菌HM-7的影响 碳源优化试验结果如图1所示，从图中可以看出，各个碳源对拮抗菌HM-7的生长影响不同，其中可溶性淀粉最差，蔗糖、麦芽糖、牛肉膏相差不大，葡萄糖作为唯一碳源时，拮抗菌HM-7的光密度值为1.990，高于其他碳源。葡萄糖为单糖，容易被细菌吸收并利用，所以当葡萄糖作为碳源时，菌体生长最好，能够达到最优状态;图2为葡萄糖作为唯一碳源时不同添加量对菌体生长的影响情况，图2表明不同的葡萄糖添加量对菌体生长也会有明显的影响。在供试浓度变化范围內出现了偏低或偏高均不利于其生长的结果，故可以得出，当添加量为0.3%时，菌体生长达到最好，此时光密度值为2.075。

2.1.2 氮源对拮抗菌HM-7的影响 氮源优化试验结果如图3所示，从图中可以看出，不同氮源对拮抗菌HM-7的生长影响差异非常显著。其中酵母膏作为唯一氮源时，拮抗菌HM-7的生长情况为最佳，此时的光密度值为2.197，蛋白胨次之，豆粕居中，氯化铵菌体生长量小，尿素最次。酵母膏高于其他有机氮源，成为最佳氮源。图4是酵母膏作为唯一氮源时不同添加量对菌体生长的影响情况，图4表明不同的添加量对菌体生长不像碳源那样明显，但也会有一定的影响。在供试浓度变化范围内说明酵母膏添加量为0.8%时更利于菌体的生长，光密度值达2.152，为最佳浓度。

2.1.3 无机盐对拮抗菌HM-7的影响 无机盐优化试验结果如图5所示，从图中可以看出，不同无机盐对拮抗菌HM-7的生长影响差异比较显著。从图5看出，KCL、NaCl、MgSO4作为唯一无机盐时，拮抗菌HM-7的菌体生长量，相差不大，光密度值均在2左右，其中NaCl最佳，此时光密度值为2.043。K2HPO4和 KH2PO4作为唯一无机盐时，光密度值明显降低，说明其不利于菌体的生长。图6为NaCl作为唯一无机盐时不同添加量对菌体生长的影响情况，结果表明不同的添加量对菌体生长也会有明显的影响。在供试浓度变化范围内出现了偏低或偏高均不利于其生长的结果，故可以得出，最合适的添加量为0.4%，此时光密度值为2.106。

2.2 正交试验结果

对碳源、氮源、无机盐3类不同培养基质以及不同添加量进行正交试验。其结果及极差分析如表2所示，通过极差的大小得出不同培养基质对拮抗菌HM-7生长的影响效果。从表2中的OD值可以看出各因素对拮抗菌HM-7生长影响效果的主次顺序为C>B>A，即无机盐（NaCl）>氮源（酵母膏）>碳源（葡萄糖）。通过OD值k值得知适合拮抗菌菌体生长的最佳组合为A1B2C2，所以最适合菌体生长的培养基配方为葡萄糖2 g·L-1、酵母膏8 g·L-1、NaCl 4 g·L-1。

3 讨论与结论

通过对培养基中不同培养基质的研究，看出拮抗菌HM-7生长受氮源和无机盐浓度的影响居多。实验得出拮抗菌HM-7生长的理想培养基配方为葡萄糖2 g·L-1、酵母膏8 g·L-1、NaCl 4 g·L-1，在此条件下拮抗菌HM-7的生长量较高，适合其生长。

相比于传统的化学防治，生物防治具有环境污染小、对人畜无害、没有残留，能够在不影响人们生活的情况下防治病虫害。随着人们更加注意环境问题，同时对绿色食品的需求有一定提高，生物防治成为了生物科学研究的热点[7]。郝建安等[8]对解淀粉芽孢杆菌进行了探究，发现其对水稻纹枯病菌、黑痘病菌等有一定的抑制作用;代玉立[9]研究枯草芽孢杆菌菌株RSS-1，发现其能够对油菜菌核病菌产生抑制;杨凡等[10]研究表明，淡紫紫孢菌pt361菌株能有效防治黄瓜根结线虫，其对线虫卵寄生率为72.6%，其菌株混合发酵液对线虫幼虫致死率达95.2%;闫建芳等[11]研究表明，链霉菌组合ST-2其发酵液对黄瓜枯萎病的相对防效达65.89%，显著高于对照申嗪霉素39.50%的效果。农业生产中，拮抗菌可以作为微生物农药来发挥作用，能够有目的性的杀害病虫，同时可以保持生态平衡，因此微生物防治相对于化学防治更加容易在人们心中扎根，具有很好的发展前景[12]。但由于人们已经长期使用化学防治来治理病虫害，并没有了解到认识到生物防治的优越性，加之生物防治实施受到多种因素影响，防治效果不稳定，因此生物防治没有大范围实施到农业和生活中，因此，在提高人们环保意识的同时，还需进行技术的指导，确保生物防治的效果，为其能够广泛应用打下坚实基础。

参考文献

[1] 张丽，孙书娥.利用微生物防治植物病害研究进展[J].农药研究与应用，2010，14（6）：10-13.

[2] 陈守坚.世界上最古老的生物防治：黄柑蚁Oecophylla smaragdina Fabr.在柑桔园中的放饲及其利用价值[J].昆虫学报，1962（4）：401-408.

[3] 唐蕊，张雪辉，殷世群，等.黄瓜枯萎病拮抗菌HM-7的鉴定[J].中国瓜菜，2016，29（8）：13-16.

[4] 钟蔚.枯草芽孢杆菌微生态制剂制备工艺研究[D].南京：南京农业大学，2013.

[5] 叶碧霞，左勇，傅彬，等.一株枯草芽孢杆菌培养基及培养条件的优化[J].食品科技，2017，42（1）：23-28.

[6] 刘文波，熊燕红，秦春秀，等.解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）HAB-7的培养基优化及抑菌活性[J].中国植保导刊，2017，37（6）：5-13.

[7] 黄曦，许兰兰，黄荣韶，等.枯草芽孢杆菌在抑制植物病原菌中的研究进展[J].生物技术通报，2010（1）：24-29.

[8] 郝建安，曹志辉，赵凤梅，等.解淀粉芽孢杆菌NK10.BAhjaWT抑真菌作用的研究[J].微生物学通报，2008，35（6）：903-908.

[9] 代玉立.枯草芽孢杆菌菌株RSS-1对油菜菌核病菌的生防作用及其机制研究[D].合肥：安徽农业大学，2015.

[10] 杨凡，蔡毓新，贾文华，等.淡紫紫孢菌对黄瓜根结线虫的防治效果[J].中国瓜菜，2018，31（7）：35-38.

[11] 闫建芳，赵柏霞，刘秋，等.链霉菌组合ST-2发酵条件优化及对黄瓜枯萎病的防治效果[J].中国生物防治学报，2016，32（4）：531-538.

[12] 周文强，樊慧梅.拮抗微生物在生物防治中的研究进展[J].辽宁农业科学，2005（5）：32-34.