茯神挥发性成分及其生物活性研究

2019-09-05王军民张加研雷福厚

天然产物研究与开发 2019年8期

王军民，张加研，雷福厚，陈凯，严毅

1西南林业大学西南山地森林资源保育与利用教育部重点实验室；2西南林业大学化学工程学院，昆明 650224；3广西民族大学广西林产化学与工程重点实验室，南宁 530006；4昆明市海口林场，昆明 650114

茯苓为多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核，是我国传统常用中药材[1]。茯神为茯苓块中穿有坚实细松根者，长宽4～5 cm，厚4～6 mm，松根直径不超过1.5 cm，边缘苓块可不成方形。茯苓中间生长的松木如为弯曲的松根，似朽木状，质松体轻，每根直径不超过2.5 cm[2]。化学合成抗真菌药物活性较好，但多数药物存在毒副作用大、抗菌谱窄、易产生耐药性等问题[3]，因此寻找一种安全可靠的生物农药就显得至关重要。与化学合成抗菌剂相比，用植物资源或其提取物制成的抗菌剂具有安全，环境友好，对人、动物等非靶标生物无害或毒性较小等优点[4]。中药挥发油一般具有很好的抗菌活性[5]，同时茯苓在松树上的生长具有绝对的优势，松树不易被其它常见真菌感染，故推测松树被茯苓代谢后的挥发性成分对其它真菌可能具有拮抗作用。现代学者对茯神化学成分及生物活性进行了大量的研究[6-8]，但茯神中挥发性成分的构成和抗菌活性研究未见报道。本研究以茯神为研究对象，优化二氧化碳超临界最佳提取工艺提取茯神挥发性成分，并对挥发性成分进行主成分分析，作用于5种常见真菌，研究挥发性成分对真菌的生物活性，旨在从茯神中探寻得到一种潜在的生物农药，为开发和探明茯神新的利用方向奠定基础。

1 仪器和材料

1.1 实验材料

茯神采于云南省临沧市双江拉祜族佤族布朗族傣族自治县茯苓种植基地，粉碎后过24目筛备用，茯苓母种为中科院5.78原种。五种真菌分别为腐皮镰孢Fusariumsolani(CGMCC 3.2889)，禾谷镰孢Fusariumgraminearum(CGMCC 3.4733)，尖孢镰孢Fusariumoxysporum(CGMCC 3.3633)，芸苔链格孢Alternariabrassicicola(CGMCC 3.7805)，采绒革盖菌Coriolusversicolor(CFCC 5336)。

1.2 实验仪器与试剂

二氧化碳超临界设备(美国ASI)；Agilent 7890A-5975B型气质联用仪(美国Agilent公司);SQP型万分之一电子天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司);高压灭菌锅(上海博迅实业有限公司医疗设备厂);超净工作台；移液枪、;恒温培养箱。容量瓶、注射器、0.22 μm无菌滤头、样品瓶、1 mL移液枪枪头、10 mL量筒、250 mL锥形瓶、培养皿、5 mm打孔器、无水乙醚、二甲基亚砜为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。

2 实验方法

2.1 超临界提取挥发油

每次称取50 g粉碎后样品进行实验，实验采取了单因素控制变量的实验方式，分别从提取压力、温度、二氧化碳的单位时间流量和提取时间4 个方面进行相应的研究实验。根据实验结果，因提取时间对提取率的影响关系较小排除时间因素的影响，在单因素试验的基础上，选择压力、温度、二氧化碳的单位时间流量(下文简称流量)共3个因素为研究对象，按照3因素3 水平进行Box-Behnken 中心组合设计试验，因素与水平编码如表1 所示。

表1 因素与水平编码

2.2 挥发油主成分分析

GC条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 μm)；柱温：80～240 ℃，程序升温3 ℃/min；柱流量1.0 mL/min；进样口温度250 ℃；柱前压100 kPa；进样量0.3 μL；分流比10∶1；载气为高纯氦气。MS条件：电离方式EI；质量范围：35～500；采用NIST14质谱库检索计算机定性。

2.3 生物活性研究

精确称取样品100 mg，用2%DMSO定容至25 mL，配制为浓度为4 mg/mL的母液，采用梯度稀释法配制浓度分别为0.2、0.4、0.8、1.2、1.6 mg/mL的待测样液，透过0.22 μm微孔过滤器除菌备用。配制1 L PDA培养基121 ℃灭菌22 min。凝固前转移至超净工作台中分装至90 mL，冷却至40 ℃时与10 mL待测样液混匀，配制得到含挥发油浓度分别为0.02、0.04、0.08、0.12、0.16 mg/mL的培养基注入无菌培养皿(9 cm直径)。每个培养皿中包含10 mL PDA培养基，标记后冷却凝固备用。溶剂对照采用不加样品的2% DMSO溶液，空白对照为不加任何样品和溶液的PDA培养基。

病原真菌的接种与培养：在已活化好的病原真菌菌落上用灭菌后的5 mm打孔器打取菌饼，后转移至培养皿中心位置，标记后放入培养箱培养3～10天。所有病原真菌应在同一天内接种完毕。

生长速率计算：培养至第2、4、6、8、10天时，用十字交叉法测量病原真菌的菌落生长直径，并记录数据。抑制率按照如下公式计算[9]。

IR(%)={Do-[Ds-(Do-Dn)]}×100%/Do

IR:抑制率；Do空白对照组菌落直径；Ds：处理组菌落直径；Dn：溶剂对照组菌落直径。

3 实验结果

3.1 超临界提取挥发油

3.1.1 单因素考察

提取压力考察：固定提取温度为50 ℃，流量为12 L/min，提取压力分别为10、15、20、25、30 MPa时，挥发油提取率分别为0.41、0.53、0.691、1.13、1.14 mg/g。实验结果表明提取压力在25 MPa以上时挥发油的提取率变化趋于平缓，考虑能耗和安全问题初步确定最佳提取压力为25 MPa。

提取温度考察：固定提取压力为25 MPa，流量为12 L/min，提取温度分别为40、45、50、55、60 ℃时，挥发油提取率分别为1.19、1.25、1.5、1.59、1.54 mg/g。实验结果表明提取温度在55 ℃时挥发油的提取率最高，故初步确定最佳提取温度为55 ℃。

提取流量考察：固定提取压力为25 MPa，温度为50 ℃，提取流量分别为6、8、10、12、14 L/min时，挥发油提取率分别为1.02、0.98、1.25、1.25、1.19 mg/g。实验结果表明提取流量在10 L/min时趋于平缓，当流量逐渐增大为14 L/min时因分离部分不能及时分离导致部分挥发油可能随气体流失使提取率反而降低。故初步确定最佳提取流量为10 L/min。

3.1.2 响应曲面试验结果与分析

响应曲面试验设计、统计及结果分析利用Design-Expert 软件进行数据分析，响应面试验设计结果见表2。利用Design-Expert 8.0.6 软件对表2 中的提取得率数值以及3个因素进行统计分析，得到了每个因子的显著性，结果如表3 所示，并得到了挥发油提取率(Y)对自变量提取压力(A)、提取温度(B)、提取流量(C)的多元二次回归方程为：提取率(Y)=1.61+ 0.13A+ 0.059B+ 0.11C+ 0.01AB+ 0.038AC-0.023BC-0.16A2-0.14B2-0.18C2由表3 的方差分析结果可知，从表3 方差分析结果可知，实验中选用的模型差异极显著(P<0.000 1)，表明该2 次方程比较显著；失拟项0.192 1>0.05，表明失拟不显著对试验拟合程度良好，试验误差较小，可以用该模型对不同条件下的试验结果进行预测。利用Design-Expert 8.0.6 软件对所得到的回归模型进行了响应面分析，并对回归方程的最值求解，得到了模型极值点，即提取压力、提取温度、提取流速分别为27.26 MPa、55.97 ℃、10.68 L/min 时，响应值Y 值达到最大，在此工艺下挥发油提取率预测值为1.66 mg/g，见图1。受仪器参数限制，设置取压力27 MPa、提取温度56 ℃、提取流速10 L/min时对最优工艺进行验证，提取率实际测定值分别为1.61、1.63、1.63 mg/g，平均值为1.62 mg/g。

表2 Box-Behnken 试验设计与结果

续表2

序号No.A 提取压力Extraction pressure(Mpa)B 提取温度Extraction temperature(℃)A 流量Flow rate of CO2(L/min)提取率Yield(mg/g)13-1101.22140111.42150001.61160001.62170-1-11.11