《中国心血管报告2018》指出，在我国心血管死亡率居首位，高于肿瘤等其他疾病，占我国居民疾病死亡构成的40%以上，据此推算，目前我国冠心病病人近1 100万人[1]，造成了严重的医疗负担和经济负担[2]。冠心丹参滴丸由三七、丹参、降香油组成，其主要化学成分包括三七皂苷R1[3-4]、人参皂苷 Rg1[5]、人参皂苷 Rb1[6]、丹参酮ⅡA[7-8]、丹酚酸B[9]、隐丹参酮、丹酚酸Ⅰ[10-11]等。本实验拟通过观察缺血心肌的线粒体内膜解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)及其通路的改变以评价冠心丹参滴丸对缺血心肌UCP2的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 3月龄普通级巴马猪，雌雄不拘，体重18～23kg，由天津市百农生物繁育科技有限公司提供。

1.1.2 实验仪器和药品 Ameroid缩窄环(美国Research Instrument SW)， 超声仪(荷兰 Philips EPIQ 7)， 高效液相色谱仪(美国 Waters e2695-2489)， 光学显微镜(日本 OLYMPUS BX43)， 透射电子显微镜(日本 HITACHIH-7650)， 电泳仪(美国 Bio-Rad)， 荧光定量PCR仪(美国 Applied BiosystemsABI7500)，AMPK抗体(美国 santacruz sc-25792)， pAMPK抗体(美国 CST 2535)， 冠心丹参滴丸(黑龙江中发实业集团)， 盐酸曲美他嗪片(天津施维雅制药)， UCP2抗体(美国santacruz sc-6525)。

1.2 实验方法

1.2.1 缺血心肌模型猪的建立 动物禁食8 h后，地西泮0.5 mg/kg肌内注射，丙泊酚2 mg/kg肌内注射，心电监护，异氟烷1%～3%吸入维持麻醉。消毒术野，开胸，游离前降支近段，第一对角支下1 cm，置入2.5 mm Ameroid缩窄环。假手术组给予开胸但不置入缩窄环。术后给予青霉素320 U 静脉输注，心电监护至苏醒，回笼，常规饲料饲养4周。

1.2.2 动物分组及给药方案 4周后成活16只，其中假手术组4只，其余12只根据简单随机法分为模型组；冠心丹参滴丸(GXDS) 组和曲美他嗪(TMZ) 组，每组4只。模型组和假手术组给予正常饮食；TMZ组在正常饮食基础上加盐酸曲美他嗪40 mg/d；GXDS组在正常饮食基础上加冠心丹参滴丸800 mg/d。给药周期共6周。

1.2.3 心功能检测 给药后，麻醉方法同上，在静息状态下通过超声心动图测定各组的心脏功能指标：左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)、射血分数(EF)、短轴缩短率(FS)、左室收缩末期内径(LVIDs)、左室舒张末期内径(LVIDd)、室壁增厚率(WT)。

1.2.4 取材 10%氯化钾15 mL耳静脉注射处死动物，开胸取心脏，生理盐水冲洗干净，取病变心肌。将1 mm3标本固定在2.5%的戊二醛中，以备透射电子显微镜下观察，10%的中性甲醛中固定，苏木精-伊红(HE)染色。

1.2.5 三磷酸腺苷(ATP)、二磷酸腺苷(ADP)、一磷酸腺苷(AMP)含量测定 动物处死后，立刻应用线粒体分离试剂盒进行线粒体分离。ATP、ADP、AMP的含量通过高效液相色谱法(HPLC)测定。磷酸腺苷总量(TAN) 和能荷(EC) 的计算公式如下：TAN=ATP+ADP+AMP；EC=(ATP+1/2ADP)/TAN[12]。

1.2.6 AMP活化蛋白激酶(AMPK)、pAMPK、UCP2表达水平 预冷RIPA蛋白抽提试剂，1∶9比例加入裂解液，匀浆3次，4 ℃，13 000 r/min离心20 min，取上清。BCA法测定蛋白浓度，每孔上样20 μg，浓缩胶恒压90 V，约20 min；分离胶恒压160 V，湿转法转膜后，将膜完全浸没于3%BSA-TBST中，室温轻摇30 min，一抗孵育，用3%BSA-TBST稀释一抗，室温孵育10 min，4 ℃过夜。AMPK稀释比例1∶200，UCP2稀释比例1∶200，次日二抗孵育，加入ECL反应，曝光。

1.2.7 AMPK和UCP2 mRNA 表达水平检测 引物在北京Invitrogen公司合成。 AMPK上游引物：CAACAAGCCCACCTGATTCTTTTCT，AMPK下游引物：ATGCCATTTTGCTTTCCTTACACCT；UCP2上游引物：TCACCCAATGTCGCTCGTA，UCP2下游引物：GGCAGGGAAGGTCATCTGT；GAPDH上游引物：GGCTACACTGAGGACCAGGTTG，GAPDH下游引物：CCAGGAAATGAGCTTGACGAA。研磨组织，提取总RNA，进行质量检测。采用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser进行cDNA反转录。Realtime PCR反应体系配置如下：2 × Master Mix10 μL，10 μmmoL 的PCR特异引物F 0.5 μL，10 μmmoL 的PCR特异引物R 0.5 μL，加水至总体积为18 μL。将混合液加到96-PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2 μL cDNA，按以下程序进行：95 ℃，30 s；40个PCR循环(95 ℃，5 s；60 ℃，40 s)。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按 (95 ℃，10 s；60 ℃，60 s；95 ℃，15 s)，并从60 ℃缓慢加热到99 ℃。

2 结 果

2.1 一般情况 术后可见接受Ameroid 缩窄环的动物活动减少，毛发粗糙杂乱，饮食差，摇尾次数减少，叫声低，挣扎力度减弱。

2.2 心脏功能检测 与假手术组比较，模型组EF和FS降低，差异有统计学意义，与模型组相比，TMZ组EF升高，差异有统计学意义(P<0.05)，GXDS组EF较模型组升高，差异有统计学意义(P<0.05)，TMZ组与GXDS组比较EF差异无统计学意义。假手术组与模型组比较，WT差异有统计学意义(P<0.05)，假手术组与TMZ组、GXDS组比较差异无统计学意义，与模型组相比，TMZ组和GXDS组WT升高，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1 各组用药干预后超声心动图功能指标比较(±s)

与假手术组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

2.3 电镜观察 从心肌线粒体电镜图可以看出，假手术组心肌内肌纤维排列紧密，线粒体形态正常，可见完整的、排列紧密的嵴；模型组心肌肌纤维排列紊乱、减少，可见非特异性细胞质，线粒体可见水肿，嵴稀疏；TMZ组和GXDS组心肌结构改变较模型组轻，可见少量非特异性细胞质，肌纤维排列尚规律，线粒体水肿较模型组轻，线粒体嵴稍有稀疏紊乱，未见明显断裂。详见图1。

a为假手术组；b为模型组；c为TMZ组；d为GXDS组图1 各组心肌线粒体电镜图

2.4 HE染色 心肌组织的HE染色可见，假手术组心肌细胞着色均匀，排列有序；模型组心肌可见心肌纤维数量减少，扭曲、排列不规则伴有炎性细胞浸润，但未见明显坏死灶；TMZ组和GXDS组可见轻度着色不均，心肌细胞排列、形态尚正常，少见炎性细胞。详见图2。

a为假手术组；b为模型组；c为TMZ组；d为GXDS组图2 各组心肌组织切片HE染色(×200)

2.5 ATP、ADP、AMP含量 HPLC法测定各组的高能磷酸化合物水平，模型组与假手术组ATP、ADP、TAN、EC水平比较差异有统计学意义(P<0.05)，AMP水平差异无统计学意义；GXDS组与TMZ组在ATP水平上较模型组高，ADP水平较模型组降低，AMP、TAN水平差异无统计学意义，而EC水平较模型组增高，差异有统计学意义(P<0.05)；GXDS组ATP和EC水平虽较TMZ组高，但是差异无统计学意义。详见表2。

表2 各组心肌能量参数和能量参数水平(±s)

与假手术组比较，1)P<0.05；与模型组比较，2)P<0.05

2.6 AMPK、pAMPK、UCP2蛋白表达水平 与假手术组相比，模型组AMPK蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义，TMZ组和GXDS组AMPK水平较假手术组升高，差异无统计学意义，但较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。各组pAMPK水平差异有统计学意义，模型组pAMPK较假手术组明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)，而TMZ组和GXDS组pAMPK水平明显低于模型组，差异有统计学意义(P<0.05)。模型组pAMPK/AMPK较其余3组明显升高，差异有统计学意义。4组UCP2差异有统计学意义(P<0.05)，模型组UCP2高于假手术组、GXDS组、TMZ组。详见图3。

与假手术组比较，*P0.05；与模型组比较，#P0.05图3 AMPK、pAMPK、UCP2的蛋白表达水平

2.7 AMPK、UCP2 mRNA水平表达 与假手术组相比较，模型组AMPK和UCP2的基因表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)。TMZ组和GXDS组干预后，AMPK和UCP2基因水平较模型组降低，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图4。

3 讨 论

本实验通过在猪的前降支置入Ameroid缩窄环，建立猪的慢性心肌缺血模型，观察其心肌收缩功能障碍、细胞能量储备以及线粒体内膜UCP2的关系。本研究结果显示，缺血导致心肌的收缩功能障碍，模型组的EF、FS、WT均较假手术组降低，GXDS组和TMZ组的EF、WT较模型组增高，模型组心肌的ATP水平降低，AMP未见明显降低，从而导致AMP/ATP升高，EC和TAN降低。GXDS组和TMZ组ATP、EC较模型组增高，差异有统计学意义。模型组AMPK和UCP2的蛋白表达水平和mRNA水平均升高，AMPK的磷酸化程度增高，GXDS和TMZ可以改善缺血引起的UCP2、AMPK和pAMPK增高。

与假手术组比较，*P0.05；与模型组比较，#P0.05图4 心肌AMPK、UCP2 mRNA表达水平

线粒体与细胞的能量生成和调节氧化应激损伤有关[13-14]，线粒体使用细胞摄取的氧气进行氧化磷酸化，电子沿着电子传递链移动，最终与氧气结合[15-17]，这一过程伴随着质子由线粒体基质向线粒体膜间隙移动，使线粒体膜间隙的电位高于线粒体基质，这种质子梯度驱使质子通过ATP合成酶转移回线粒体基质，这时将ADP磷酸化为ATP[18-19]。UCP2是一种线粒体内膜蛋白，介导跨线粒体内膜的质子流，又叫作“质子漏”，UCP2使通过线粒体呼吸链复合物进入线粒体膜间隙的质子直接进入线粒体基质，而不通过ATP合成酶，使氧化磷酸化解偶联[20]，减少ATP的生成。其上游AMPK是细胞能量代谢的总开关[21]，缺血心肌中AMP/ATP比值的升高导致AMPK的激活[22]，进一步激活UCP2。这一系列的变化导致缺血心肌的高能磷酸化合物减少，能量储备降低，导致心肌收缩功能的障碍，表现为EF和WT等参数的降低。

本研究结果显示，冠心丹参滴丸可以改善处于缺血状态心脏的心功能，提高射血分数和室壁增厚率，其结果符合其他以人类为研究对象的临床研究结论[23]，其机制可能是冠心丹参滴丸可以增加心肌的高能磷酸化合物的含量，提高能荷，降低导致质子漏的UCP2和其上游AMPK的基因水平和蛋白表达，减少AMPK的磷酸化。