常琳 毛玉兰 黄茂华

AFP阴性肝癌(AFP-negative hepatocellular carcinoma，AFP-NHCC)是一类较为重要的肝癌类型，因其肿块较小，影像学检查易漏诊[1]。目前对于AFP-NHCC的诊断仍然缺乏理想的标记物。微小RNA(MicroRNA，miR)是一种非编码小RNA，其可通过靶向作用3’非翻译区调控下游基因转录后翻译[2-3]。近年已发现多种miR在HCC患者组织及体液中有差异表达，并有望作为HCC诊断的分子标志物[4-5]。本实验通过比较AFP-NHCC、肝脏良性疾病及健康人群血清miR-451、miR-21与miR-200c水平，旨在寻找更有效的AFP-NHCC生物标志物。

资料与方法

一、研究对象

选取2015年7月至2018年5月在我院经病理学确诊AFP-NHCC患者120例，其中Ⅰ-Ⅱ期患者79例，Ⅲ-Ⅳ期患者41例；发生淋巴结转移33例，未发生淋巴结转移87例。同期收取120例肝脏良性疾病(乙型肝炎78例、肝硬化42例)和120例于我院健康体检者。本项目经医院伦理委员会审批。

二、 血清miR-451、miR-21与miR-200c表达水平的检测

使用促凝采血管收集AFP-NHCC患者和肝脏良性疾病患者接受治疗前和健康对照者入院体检时外周血5 mL，分离血清。

按血清RNA提取试剂盒说明书步骤进行总血清RNA提取，使用茎环法将RNA逆转录为cDNA，进行实时荧光定量PCR检测。反应条件：95 ℃变性5 min；95 ℃ 30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40个循环。引物序列见表1。采用2-ΔCt法计算相对表达量。miR-451、miR-21、miR-200c和U6基因熔解曲线峰型单一。

表1 扩增miR-451、miR-21、miR-200c和U6的引物序列

三、 统计学分析

应用SPSS 19.0软件进行分析。计量资料采用均值±标准差表示，两组间和多组间比较分别采用两独立样本t检验和方差分析。率的比较采用卡方检验。相关性分析采用Spearman检验。受试者工作特征曲线(ROC)比较各指标对AFP-NHCC的鉴别能力。二元Logistic回归计算各指标预测AFP-NHCC的比值比(OR)。P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、基本资料及血清miR-451、miR-21、miR-200c水平比较

如表2所示，三组间各基本资料比较差异均无统计学意义(P>0.05)。AFP-NHCC患者miR-21水平(10.3±2.3)显著高于肝脏良性疾病(4.5±0.9)和健康体检者(4.0±0.5)，P<0.05；AFP-NHCC患者miR-451(43.4±5.1)和miR-200c(12.8±0.6)水平显著低于肝脏良性疾病(miR-451：103.3±10.4；miR-200c：25.8±1.3)和健康体检者(miR-451：99.8±10.7；miR-200c：24.1±1.2)，P<0.05；而肝脏良性疾病和健康体检者间各指标差异均无统计学意义(P>0.05)。

二、AFP-NHCC各指标与血清miR-451、miR-21、miR-200c的相关性

血清miR-451、miR-21、miR-200c水平与淋巴结转移(miR-451：r=-0.521，P=0.006；miR-21：r= 0.505，P=0.020；miR-200c：r=-0.486，P=0.023)及TNM分级(miR-451：r=-0.513，P=0.016；miR-21：r= 0.591，P=0.003；miR-200c：r=-0.539，P=0.007)呈线性关联，见表3。

三、 血清miR-451、miR-21、miR-200c对AFP-NHCC的鉴别价值

在联合血清miR-451、miR-21、miR-200c时区分AFP-NHCC与肝脏良性疾病患者和健康对照的灵敏度显著提高达到89.3%，见表4和图2。

四、 血清miR-451、miR-21、miR-200c对AFP-NHCC的风险评估

二元logistic回归指出，血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平是AFP-NHCC发病的危险因素(P<0.05)，见表5。

讨 论

miR-451、miR-21和miR-200c是近年研究发现的在HCC中起重要调控作用的三个非编码RNA。Liu等[6]应用脂质体转染miR-451模拟物于Hep G2细胞以上调Hep G2细胞中miR-451的表达，发现上调miR-451后可显著抑制Hep G2细胞的增殖、侵袭与迁移能力。Guo等[7]的研究发现，瞬时转染miR-21模拟物的Huh7细胞系，其增殖与迁移能力均显著提高。Oishi等[8]则发现miR-200c在HCC患者癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织，当患者手术切除癌组织后外周血浆miR-200c水平较术前显著升高。机理研究显示miR-200c可通过抑制抑癌基因MAD2L1表达以促进HCC的进展[9]。前期研究提示，miR-451和miR-200c在HCC中扮演抑癌基因，而miR-21则发挥促癌基因功能。

表2 基本资料比较

表3 AFP-NHCC各指标与血清miR-451、miR-21、miR-200c的相关性分析

表4 血清miR-451、miR-21、miR-200c对AFP-NHCC的ROC分析结果

A图为miR-451、miR-21与miR-200c鉴别曲线；B图为联合检测曲线

图1 血清miR-451、miR-21、miR-200c对AFP-NHCC鉴别价值

注：*为校正年龄、性别、吸烟、饮酒等因素后

本研究我们通过临床样本血清中的检测发现，AFP-NHCC患者血清miR-21水平显著高于肝脏良性疾病和健康对照，而miR-451和miR-200c水平显著低于肝脏良性疾病和健康对照，与前期在HCC中的研究结果相符[6-9]。进一步分析发现，低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平与AFP-NHCC患者发生淋巴结转移和TNM分级相关，且在淋巴结转移和Ⅲ-Ⅳ期患者中miR-451和miR-200c降低最显著，而miR-21升高也最显著，表明血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c与AFP-NHCC的发生发展关系密切。

ROC分析提示，血清miR-451、miR-21和miR-200c在区分AFP-NHCC与肝脏良性疾病患者和健康对照的灵敏度/特异度分别为77.3%/81.9%、80.7%/84.7%和69.2%/67.3%；而联合三者后在区分AFP-NHCC与肝脏良性疾病患者和健康对照的灵敏度显著提高，达到89.3%。二元Logistic回归在校正年龄、性别、吸烟、饮酒等因素影响后，血清低miR-451、高miR-21和低miR-200c水平仍是AFP-NHCC发病的独立危险因素。上述研究我们发现，血清miR-451、miR-21和miR-200c在AFP-NHCC鉴别诊断及风险评估中均有一定价值。然而，本次研究有以下不足：(1)miR-451、miR-21和miR-200c联合诊断模型的确切价值有待大样本量的前瞻性研究进行验证；(2)miR-451、miR-21和miR-200c三者虽与淋巴结转移及分期相关，但由于我们未能获取患者随访数据，因为对于三者在AFP-NHCC的预后价值有待进一步探讨。