张晓飐 宋锐锋 李芙蕾

慢性乙型肝炎病毒学发病机制主要是乙型肝炎病毒(HBV)感染，而HBV属不完全环状双链DNA病毒范畴，细胞毒性并不明显，可诱发急或慢性肝炎发生[1]。其中外周血单个核细胞干扰素刺激基因(Stimulator of interferon gene，STING)基于双链DNA刺激下，其介导细胞产生白细胞介素6等细胞因子，诱导细胞发挥抗细菌及病毒作用，并且其自身可直接作为模式识别受体，引发IFN反应。近几年，有报道发现STING蛋白水平高低与天然免疫反应强度有关[2]。基于此，本文主要围绕外周血单个核细胞STING表达水平以及HBV复制两者的相关性进行分析，为临床HBV感染治疗提供参考依据，报道如下。

资料与方法

一、 一般资料

纳入2016年12月至2018年12月于我院收治的68例慢性乙型肝炎患者及同期54例健康体检者，研究对象均知情，纳入标准：(1)符合慢性乙型肝炎相关诊断标准[3]，均经肝穿刺组织等检查确诊，乙肝表面抗原阳性≥6个月；乙型肝炎病毒脱氧核糖核酸≥2 000 IU/mL；血清总胆红素≥171 μmol/L，国际标准化比率≥1.5(凝血酶原活动度≤40%)；年龄>18岁；(2)正常对照组：年龄>18岁；身体健康，肝肾功能等基础实验室检测指标均正常，精神行为正常；自身免疫性疾病诊断标志物呈阴性；乙肝表面抗原呈阴性。排除标准：(1)伴心、肺、脑等严重原发疾病；(2)合并肝癌等恶性肿瘤；(3)合并肝硬化及酒精性、药物性、遗传代谢性、自身免疫性肝病；(4)伴甲、丙、戊型等其他肝炎病毒感染；(5)入组前半年内接受抗病毒、肝移植等干预；(6)伴非嗜肝病毒感染引起的肝组织炎症；(7)精神疾患；(8)孕妇及哺乳期妇女。观察组68例患者中，男45例，女23例，年龄18～75(53.78±9.56)岁；正常对照组中男34例，女20例，年龄20～78(54.12±9.71)岁。两组性别、年龄一般资料比较差异无统计学意义(P>0.05)。本试验经伦理委员会批准。

二、方法

(一)主要仪器及试剂 主要仪器包括2720型聚合酶链反应PCR基因扩增仪(美国ABI公司)、ViiATM7型实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-PCR)仪(美国Life Technologies公司)、Q300高精度紫外分光光度计(美国Quawell公司)、Fluor Chem FC2凝胶成像系统(美国Alpha公司)，其他仪器如台式高速离心机、电子天平等均购自德国Eppendorf公司。主要试剂包括9mL二胺四乙酸抗凝真空采血管(美国Becton Dickinson公司)、Trizol试剂和逆转录试剂盒(美国Thermo公司)、SYBR Premix Ex TaqⅡ(日本TaKaRa Bio株式会社)、Thermo Scientific反转录试剂盒(美国Thermo公司)、HBV DNA病毒载量检测试剂(凯杰生物工程有限公司)。

(二)引物设计 引物设计参考美国国立生物技术信息中心网站提供的STING mRNA序列(确保PCR扩增产物溶解曲线显示单峰，预期设计长度与琼脂糖凝胶电泳结果提示的目的基因片段长度一致，且目的条带单一清晰，则示引物特异性较好)，见表1。

表1 PCR引物设计

(三) mRNA提取、逆转录 收集空腹静脉血2 mL，置入二胺四乙酸抗凝真空采血管中，参考淋巴细胞分离液说明书，行外周血单个核细胞分离。采用Trizol法提取单个核细胞总mRNA，行RNeasy Mini Kit纯化。采用Q300高精度紫外分光光度计测定RNA浓度和A260/A280吸光度比值(确保在1.8～20.0之间)。逆转录时，取RNA模板1 μL，将oligo引物1 μL加入其中，混匀后离心，65℃ 5 min，于冰上加入逆转录反应体系(Mix 2 μL，Reaction Buffer 4 μL，RT、RI各1 μL)。反应条件：42℃ 60 min，72℃ 10 min，4℃保存。cDNA产物获取后置-20℃条件下保存。

(四)STING mRNA、IFN-α mRNA、IFN-β mRNA检测 RT-PCR反应体系：总体积为20 μL，上、下游引物均1 μL，cDNA 1 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ 10 μL，ddH2O 7.6 μL，ROXⅡ 0.4 μL。GAPDH、STING、IFN-α、IFN-β、内参基因扩增反应设置相同，如下：30s 94℃下预变性，后20s内在94℃下变性，60℃变性20 s，72℃延伸35 s，PCR循环50个。同时，于60～95℃时行溶解曲线分析。以相对表达量△Ct比较所有基因mRNA表达，△Ct=Ct目的-Ct内参。进行扩增效率验证，GAPDH、STING、IFN-α、IFN-β基因10倍稀释(梯度5个)，目的基因和内参基因扩增效率相差<5%，处于98%～102%间，扩增效率类似。

三、观察指标

统计两组IFN-α mRNA、STING mRNA以及IFN-β mRNA 的相对表达量，分析不同乙型肝炎病毒DNA(HBV DNA)载量与STING及干扰素基因相对表达量的相关性。

四、 统计学方法

结 果

一、 两组STING mRNA、IFN-α mRNA、IFN-β mRNA 相对表达量比较

观察组STING mRNA、IFN-α mRNA、IFN-β mRNA 相对表达量显著高于正常对照组(P<0.05)，见表2。

表2 两组STING mRNA、IFN-α mRNA、

二、HBV DNA载量与STING及干扰素基因相对表达量的关系

按HBV DNA不同载量分为≤104IU/mL组(19例)、104IU/mL～组(18例)、105IU/mL组(14例)、>106IU/mL组(17例)。HBV DNA载量>106组、105组、104组STING mRNA相对表达量均显著高于HBV DNA载量≤104组(P<0.05)，见表3。

表3 慢性乙型肝炎患者不同HBV DNA载量与STING及干扰素基因相对表达量的关系(±s)

注：与>106组比较，①P<0.05；与105～组比较，②P<0.05；与104～组比较，③P<0.05

三、慢性乙型肝炎患者STING mRNA与HBV DNA载量及干扰素基因相对表达量的相关性

经直线相关分析显示，慢性乙型肝炎患者STING mRNA相对表达量与HBV DNA载量呈弱相关性(r=0.340，P=0.000)，与IFN-α mRNA、IFN-β mRNA相对表达量均呈正相关(r=0.517、0.511，P=0.000、0.000)，见图1～3。

图1 STING mRNA与HBV DNA载量线性相关图

图2 STING mRNA与IFN-α mRNA线性相关图

图3 STING mRNA与IFN-β mRNA的线性相关图

讨 论

细胞质DNA属重要免疫刺激物质，多源自病原微生物侵入人体后复制所致外源性DNA及机体组织、细胞受损后所致内源性DNA，可诱导机体天然免疫反应被激活，形成大量IFN及其他细胞因子。IFN主要包括两种亚型，即IFN-α、IFN-β，前者主要源于白细胞(如树突状细胞)中，后者起源于成纤维细胞。STING属DNA传感器环鸟苷-腺苷酸合成酶和RNA传感器人视黄酸诱导基因下游细胞信号级联中衔接蛋白，其介导信号传导通路可识别多种入侵病毒[4-6]。其中，HBV病毒基因组属部分双链环状DNA，宿主体内可演变为超螺旋环状、闭合、共价DNA分子，可作为模板转录出前基因组RNA及其他mRNA，被认为是隐形病毒。

本研究发现，观察组STING mRNA、IFN-α mRNA、IFN-β mRNA 相对表达量明显高于正常对照组，且慢性乙型肝炎患者体内HBV DNA载量越高，其STING mRNA相对表达量也明显增多，这与Pépin G[7]等报道结论一致，证实体外或体内STING过度表达均可抑制HBV复制，且除固有免疫反应外，STING调节机体对HBV的适应性免疫反应。另外，本研究结果显示，慢性乙型肝炎患者STING mRNA相对表达量与HBV DNA载量呈弱相关性，与IFN-α mRNA、IFN-β mRNA 相对表达量均呈正相关。Hua X[9]等也认为激活cGAS-STING通路，可抑制HBV复制。cGAS属细胞质dsDNA感受器，与细胞质中DNA结合，催化作用下产生cGAMP；而cGAMP可诱导STING激活，导致下游IFN生成及抗病毒效应被激活。考虑到HBV复制期间可形成d3DNA、ssDNA，故笔者推测STING参与识别HBV复制中间体及HBV清除调节过程，其过度活化会破坏机体免疫耐受，诱发慢性乙型肝炎。

综上，慢性乙型肝炎患者机体内STING相对表达量明显升高，且STING过度表达干扰HBV复制，证实慢性乙型肝炎患者机体抗HBV免疫应答中STING起着重要作用，临床应引起足够重视。但本研究中由于样本量偏小，STING抗HBV感染具体机制有待今后进一步深入研究。