高晨轩，南志标

（兰州大学草地农业生态系统国家重点实验室 / 兰州大学农业农村部草牧业创新重点实验室 /兰州大学草地农业科技学院，甘肃 兰州 730020）

牧草种子是草地生态建设与畜牧业生产发展的基础，随着我国畜牧业和农业结构调整，退耕还草与栽培草地建设等项目的不断实施，可以预见在未来我国对牧草种子的需求量巨大[1-2]。同时，种子作为高等植物的繁殖器官会携带大量的病原微生物，在这些病原微生物中真菌是对种子质量影响最大的一类微生物[3-4]。病原真菌可以通过多种方式进行传播(混于种子间、附于种子外部或寄生于种子组织内部)，并且在种子的收获期、贮藏期与幼苗的生长期均可造成严重的危害。种带真菌能够降低种子的发芽率并影响种子活力，引起种子的生理生化异常，进而导致种子质量的降低，最终会严重影响牧草种子的质量和产量，并造成巨大的经济损失。种带真菌除寄生于种子上还会在其他环境(土壤、植物残体和杂草上)中生存，并且会在环境适宜时再次造成侵染。因此了解种带真菌，进而采取相应的措施是防治病害的重要手段[5-9]。本文就近年来我国牧草种带真菌研究加以综述，以期为种带真菌的研究提供基础资料和理论依据，同时也为减少种带真菌造成的经济损失提供相关的科学依据。

1 种带真菌的检测方法

种带真菌的分离与检测是研究种带真菌进而采取相应防治措施的重要基础。国际种子检验协会(International Seed Testing Association，ISTA) 1993年指出，健康的种子是指种子上的病原微生物存在较少，且种子应具有良好的生理状态。理想的种带真菌监测方法应该具有敏感度高、简捷、经济等优点[10]。目前常见的种带真菌检测方法大致有8种，其特点亦不相同(表1)。

表1 种带真菌常见的检测方法Table 1 Common detection methods of seed-borne fungi

2 我国牧草种带真菌

截至2018年，我国科研工作者共对12种牧草种子的种带真菌进行了分离研究(表2)，分别为沙打旺(Astragalus adsurgens)、燕麦(Avena sativa)、小冠花(Coronilla varia)、老芒麦(Elymus sibiricus)、偃麦草(Elytrigia repens)、羊草(Leymus chinensis)、多年生黑麦草(Lolium perenne)、苜蓿(Medicago)、红豆草(Onobrychis viciaefolia)、苏丹草 (Sorghum sudanense)、红三叶(Trifolium pratense)和草木樨(Melilotus suaveolens)。其中，豆科牧草6种，禾本科牧草6种。种样来源包括中国、澳大利亚、丹麦、新西兰、美国和加拿大共计6个国家。中国的种样来源包括甘肃、新疆、青海、河北、河南、江苏、辽宁、吉林、内蒙古、宁夏、山东、山西、陕西和黑龙江共计14个省。

表2 我国已检出的牧草种带真菌Table 2 Seed-borne fungi isolated from forage in China

针对6种重要牧草的种带病原真菌的致病性在培养皿中进行了初步测定(表3)，共分离得到种带真菌50个属，可大致分为3类：1)病原真菌，在一定条件下会严重影响种子质量并抑制幼苗生长，如镰刀菌(Fusariumspp.)、离蠕孢(Bipolarisspp.)、粉红单端孢(Trichothecium roseum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)等[8,28]；2)拮抗菌，通过代谢产物或者竞争作用等方式抵抗病原菌，如枝顶孢(Acremoniumsp.)、球毛壳菌(Chaetomium globosum)等[29-30]；3)贮藏真菌，种子收获后在贮藏期间传播的真菌，如曲霉(Aspergillusspp.)和青霉(Penicilliumspp.)等[31-32]。

续表2Table 2 (Continued)

3 影响种带真菌的因素

3.1 环境条件

由于每种真菌孢子发育、繁殖、侵染和传播所需的环境条件不同，不同种子种带真菌的种类和数量均不相同，即使是同一种子，在不同培养条件和不同培养基质上的带菌情况也会存在差异[33]。李春杰和南志标[8]在研究苜蓿种带真菌区系时发现，不同产地的各种样之间其带菌率存在差异，相同产地的不同品种之间其种子带菌率也存在很大的差异。湿润半湿润地区带菌率较高，干旱地区带菌率较低。带菌率最高可以达到100%，最低仅为0.75%。沙打旺的带菌率与其成熟、收获期的气候条件息息相关，即湿润度越高，种子带菌率越高[5]。其中产自淮阴的种子带菌率最高，为20%；产自保定的种子带菌率最低，达到4.5%。收获期的湿润度与种子带菌率极显著正相关(P＜ 0.01)，R2= 0.987。

表3 种带真菌致病性测定Table 3 Pathogenicity of seed-borne fungi

3.2 贮藏条件

随着贮藏时间的延长，紫花苜蓿带菌种子数量下降，主要种带真菌交链孢、曲霉和枝孢的检出率也随之下降[31]。室温条件下贮藏300 d较贮藏60 d的种子真菌检出率降低了3%。同时，随着温度湿度的增高，有利于贮藏真菌的生长发育和繁殖，表现出苜蓿种带真菌检出率逐渐增高。室温条件下种子带菌率仅为10%；在35 ℃，10%种子含水量的条件下，种子带菌率达到了29%。老芒麦带菌率亦是随着储藏时间的增加呈下降趋势[20]。其中，2010年收获的种子带菌率为38%，显著(P＜ 0.05)高于其之前收获的种样带菌率，造成这种现象的原因可能是随着储藏时间的增加，不能适应贮藏环境条件的真菌渐渐被淘汰掉，另一方面随着时间的增加，老芒麦种子的休眠不断被解除，而真菌侵染速率随着种子的萌发而降低[20,33]。

3.3 种子部位

真菌在种子的部位直接决定了病害发生的强度[34]。种子的不同部位其种带真菌的种类与数量亦会不同。有研究表明，种带腐生真菌多存在于种子表面，种子胚上几乎不存在[35]。对淮阴沙打旺种样解剖检测表明，85.7%的沙打旺种带真菌存在于子叶内[5]。检测多年生黑麦草种带真菌存在部位时发现，黑麦草稃壳上检出真菌15种，胚乳检出16种而胚上仅检出6种[21]。检测苏丹草种带真菌时亦发现，种皮检出真菌最多，达到13种；颖壳次之，为12种；胚乳检出10种而胚内检出真菌最少(7种)[36]。造成这种现象的原因主要为真菌入侵时，种子的形态结构是否能够对之造成入侵障碍[37]。同时亦与真菌种类及其入侵强度息息相关。

4 种带病原真菌的防治

南志标[37]提出建立我国牧草病害可持续管理防治体系，即“以信息技术、生物技术和经济学与社会学的知识为技术支撑，通过抗病品种的利用和对草地的持续管理，并辅以杀菌剂拌种和生物防治等措施，将病害控制在经济阈值水平之下，达到提高草地农业生态系统整体生产力和稳定性的目的”。目前，我国牧草种带真菌常见的防治方法有4种。

4.1 热水处理

热水处理法具有易于操作，对种子及生态环境影响较小的优点。Nan等[38]检测柱花草(Stylosanthes guianensias)种子的种带真菌之后，确认种带真菌多位于种皮，故选择了热水处理进行防治用以替代化学杀菌剂。经过试验确定将种子于55 ℃的热水中浸泡10 min防治效果最佳，种子被感染率下降31%。若继续提高温度和浸泡时间，可以减少种带真菌的数量但会造成对种子的不良影响，如发芽率降低，死种子数量的增加。张颖[21]发现，经过45 ℃热水处理20 min的多年生黑麦草种子可降低其种子带菌率35%，减少死种率10%，且不影响种子的发芽率。但是使用热水处理要注意温度控制在适宜范围内，因为热水处理不当会导致发芽率的降低。

4.2 微波处理

研究表明，使用微波处理可以达到安全、高效的灭菌效果，但是要注意处理时间与微波强度的控制，以保证种子活力不受影响[39]。适当强度的微波处理不但能够降低披碱草种子的带菌率，而且可以显著促进其芽的生长及幼苗鲜重和株高的增加[40]。测试发现，在150 W功率下进行40 s的微波处理不但能够有效降低种子的带菌率55.83%，且不影响种子的活力，还可以进一步促进幼苗的生长以及生物量的积累，处理后幼苗苗长提高了15.87%，株高提高了10.49%。

4.3 干热处理

干热处理在一定处理范围内不但可以杀菌，而且能够促进种子萌发与幼苗生长。但是，处理的温度和时间应控制在种子可以耐受的范围之内，反之种子的活力会深受影响。研究发现，75 ℃处理20 d能使披碱草种子带菌率从93.17%显著降到0(P＜ 0.05)[41]。同时，种子发芽率、发芽势、发芽指数、活力指数和幼苗鲜重分别显著提高36.37%、73.94%、50.38%、63.38%和7.79%，且在幼苗生长初期对芽和根的生长有促进作用，处理后芽长、根长分别增加了0.54%和14.43%。

4.4 杀菌剂拌种

杀菌剂拌种是指在播种之前，使药剂与种子充分搅拌混匀。拌种不但可以起到防病治虫的效果，而且对种子危害很小，已经广泛应用于种子的生产活动中。南志标团队曾系统论述了在牧草病害防治过程中，杀菌剂拌种的应用及其优点[42-43]，并指出杀菌剂拌种是一种有效且经济的病害防治方式。总体而言，杀菌剂拌种之后种子的发芽率和出苗率可显著提高，但会因为杀菌剂种类、拌种对象、土壤条件和拌种种子活力的不同，造成拌种之后效果各异[44-45]。针对紫花苜蓿、多年生黑麦草、高羊茅、草地早熟禾(Poa pratensis)和苏丹草的试验表明，不同杀菌剂拌种之后，多数杀菌剂可以显著(P＜ 0.05)提高种子发芽率，促进幼苗生长，提高生物量(表4)。

4.5 其他措施

近年来，一些新兴的防治种带真菌的方法在其他植物的种子上取得了良好的防效，但未在牧草种子上进行相关研究。

臭氧作为一种广谱杀菌剂在农业生产中应用越发广泛。臭氧的杀菌作用原理为单原子氧的氧化作用。单原子氧与引起植物病害的各种病原物接触之后，氧化其组织蛋白，进而使之失去活性甚至死亡。研究发现，2～6 mg·L-1的高浓度臭氧水对高粱(Sorghum bicolor)种子进行处理，种子在2 mg·L-120 min和6 mg·L-110 min处理条件下，发芽霉变率最低，仅为6%[47]。在研究水稻(Oryza sativa)种子灭菌方法时发现，超声波和臭氧水结合处理水稻种子可以显著提高杀菌效率，用超声波结合臭氧水处理3 h后杀菌率可以达到90%[48]。

王玉霞等[49]以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的发酵液为原料，制成生物拌种剂，应用于玉米(Zea mays)种子防治种传和土传病害。结果表明，该生物制剂对根腐病的防效超过80%，对黑穗病的防效超过74.6%，对地下害虫防效超过66.7%，同时可以使玉米增产8.7%～5.7%。但是环境因素会影响生防物质的防效，其稳定性和持续性均会发生变化。黄曦等[50]指出，为实现生防物质互补、多种病害兼防、作用持久的良好防治效果可考虑将生防物质配合化学药剂使用或者配合使用多种生防物质。

表4 杀菌剂对牧草种带真菌的防治效果Table 4 Effect of different fungicides on seed-fungi of forage

5 问题与展望

相较于种带真菌造成的危害，牧草成株后的病害往往更易引起人们的重视，但是种子作为植物生活史的重要阶段同时也是植物生活史的薄弱环节，更易受到各种生物或非生物的胁迫影响，因此要更加重视种带真菌的检测与防治以减少未来可能发生的病害[51-54]。目前，我国牧草种带真菌的研究已取得了巨大的进展，但是仍需加强以下几个方面：1)牧草种带真菌的检测大多采用培养方法进行分离纯化，在今后的研究中为得到更加全面准确的种带真菌信息，需进一步结合非培养的分子生物学方法进行研究。2)多数研究表明，种带病原真菌会对种子带来严重的不利影响，如抑制种子发芽与幼苗生长，降低种子质量。但是造成该影响的具体物质究竟是什么，及其影响种子质量的详细作用机制尚需进一步进行深入研究。3)有关牧草种带真菌的防治研究尚不全面，应加大研究力度争取全面覆盖所有的重要牧草，以达到科研与生产实践结合的目的。