岳莹雪,王玉琦,闫芬芬,李 娜,李柏良,霍贵成

(东北农业大学乳品科学教育部重点实验室,黑龙江哈尔滨 150030)

丁酸又称酪酸,是一种短链脂肪酸,无色至浅黄色透明油状液体,具有浓烈干酪般不愉快气味,广泛应用于工业化学品、动物饲料添加剂、食品和药品等领域,每年全球市场量超过8×104吨[1]。丁酸作为一种重要的精细化工原料,主要用于制造丁酸纤维素和合成丁酸酯。合成丁酸的化学方法主要有3种:正丁醛氧化法、正丁醇氧化法及丙烯羰基化法。此外,许多从废水、土壤、受污染的乳制品和食品、肉类和动物消化系统中分离的菌株适合生产生物丁酸,目前共报道了超过10种产丁酸的菌株(如梭菌属、丁弧菌属、丁杆菌属、真细菌属、大梭杆菌属和八叠球菌属)[2]。虽然生物合成方法生产丁酸的生产率低,丁酸回收成本高[3],但消费者更喜欢天然来源的丁酸,尤其是在食品添加剂和药品领域。随着食品工业副产品供应量的增加,消费者对丁酸生产的有机天然产品的需求增加,通过微生物发酵法生产的丁酸在食品添加剂、药品和防腐剂等方面发展趋势较好。在食品领域中丁酸还可被用作乳酸工业中的酸或作为食物酯形式的添加剂来增加水果香味[4]。在其他方面丁酸被视为未来再生的绿色化学品之一,可以替代化石燃料使用,并减少与健康和环境有关的问题,包括温室气体排放,全球变暖和气候变化。同时,丁酸还具有促进健康的作用,如为肠上皮细胞提供能量并且保护肠黏膜屏障中的机械和化学屏障[5]。人和动物胃肠道中都有大量产丁酸的微生物,这些微生物及其发酵产物丁酸对宿主有着重要的意义,具有维护肠道健康、增强机体免疫、诱导肿瘤细胞凋亡、抗氧化等多重生理功能。因此,深入研究丁酸生产的方法及其调节肠道的生理功能具有重要的意义。本文主要综述了生产丁酸的方法以及其在肠道中的生理功能,为进一步研究丁酸生理功能的作用机制提供理论参考。

1 丁酸的生产方法

1.1 丁酸的化学合成

1.1.1 正丁醛氧化法 正丁醛氧化法是以正丁醛为原料,以空气或氧气为氧化剂,在有无催化剂的情况下均可完成的一种反应。韩奎武等[6]通过分子氧液相氧化利用正丁醛生产正丁酸,在不使用催化剂、最佳反应温度为55～60 ℃、反应时间6～7 h、氧气流量10.8～11.8 L/h和反应液中过氧化物质量分数1.4%的条件下,得到反应液中正丁酸质量分数为82%～86%。反应原理为:CH3CH2CH2CHO+O2→CH3CH2CH2COOOH;CH3CH2CH2CHO+CH3CH2CH2COOOH→2CH3CH2CH2COOH。李兴存等[7]研究了塔式反应器的氧化反应过程,在氧醛摩尔比0.75～0.875、反应温度50～60 ℃、催化剂与正丁醛的质量比0.1%～0.2%条件下反应3 h左右,正丁醛的转化率在99.5%以上,而正丁酸的选择性超过了95.0%。其反应原理主反应为CH3(CH2)2CHO+1/2O2→CH3(CH2)2COOH,副反应为CH3(CH2)2CHO+2O2→CH3CH2COOH+CO2+H2O;CH3(CH2)2CHO+O2→CH3CH2CH2OH+CO2;CH3(CH2)2COOH+CH3(CH2)2OH CH3(CH2)2CO2(CH2)2CH3+H2O。试验流程如图1所示。

图1 正丁醛氧化制备正丁酸试验流程图

1.1.2 正丁醇氧化法 杨长安等[8]采用新工艺将TS分子筛作为催化剂,H2O2作为氧化剂,催化氧化正丁醇生产正丁酸,得到最佳生产工艺条件为:W(TS)/n(正丁醇)为6.1 g/mol,n(正丁醇):n(H2O2,30%)为1∶3,反应温度为90 ℃、反应时间为12 h,此时正丁醇的转化率可达100%,选择性在99.5%以上。

1.1.3 丙烯羰基化法 丙烯羰基化法以丙烯与合成气为原料,其工艺分为两步进行:首先丙烯羰基化生成丁醛,而后在丁醛生成塔中通入氧气使丁醛氧化产生丁酸,但该法在生产丁酸的过程中会产生一种副产物异丁酸。若以SnCl2、CoCl2和FeCl3的Pd(PPh3)Cl2为催化剂,则可提高生产正丁酸的选择性以抑制副产物的生成[9]。

其中,正丁醛氧化法具有原料单一、工艺路线简单、生产控制方便、产品收率较高等优点。正丁醇氧化法具有高效、清洁、成本低的特点,并且催化剂易于回收重复利用,具有广阔的应用和市场前景。因此采用此两种方法优势较大,其中正丁醛氧化法应用较早。相比前两种方法,丙烯羰基合成法由于生产投资较大,在生产过程中存在中间产物正丁醛,随着工业中普遍应用正丁醛氧化制正丁酸,丙烯羰基合成法已逐步被淘汰。

1.2 丁酸的生物合成

1.2.1 梭菌合成丁酸 在几种厌氧梭菌(丙酮丁醇梭菌、酪酸梭菌、拜氏梭菌)发酵过程中,丁酸为主要终产物[10]。其中酪酸梭菌具有营养需求简单、丁酸产率高以及对毒性代谢物有更好耐受性等特点,因此被证明是丁酸工业生产中最具前途的梭菌之一[11]。用葡萄糖和木糖作为碳源,两碳源均经反应生成丙酮酸,最终生成主要产物丁酸,其中会伴随少量乳酸、乙酸、丁醇的产生,在梭菌中合成丁酸的具体代谢途径如图2所示。有研究报道[12],酪丁酸梭菌通过删除乙酸激酶基因,构建了一个名为PAK-Em的突变体,在纤维床生物反应器中的固定化细胞发酵系统的细胞固定化发酵下,最终的丁酸浓度和丁酸产量分别达到50.1和0.45 g/g的较高水平。

图2 以葡萄糖和木糖为碳源的梭菌中丁酸合成的代谢途径。

微生物法生产丁酸的反应途径还可利用基因组分析进行进一步研究,目前,已知酪丁酸梭菌ATCC 25755的完整基因组序列[13],使研究人员能够全面了解丁酸生产过程中的微生物生理反应。对酪丁酸梭菌的全基因组和蛋白质组学进行分析,将促进以代谢工程法生产丁酸的发展[14]。Chi等[15]研究发现,以梭菌ATCC 27405和梭菌ATCC 49875共培养分批发酵稻草,丁酸产量高达33.9 g/L。Song等[16]用褐藻和裙带菜生产丁酸,在适当的条件下酪丁酸梭菌的丁酸浓度达到11 g/L。Lee等[17]研究发现,一种含有半乳糖作为主要碳水化合物的红藻也被用于生产丁酸,当使用经酸预处理的红藻水解产物时,梭菌 S1的丁酸产量为4.83 g/L。因此,梭菌是生产丁酸重要的微生物。

1.2.2 其它生物方法合成丁酸 目前,葡萄糖、糖蜜、玉米和小麦等已被广泛用于丁酸的生产[18]。然而,糖基原料是食品供应或动物饲料中的主要成分,用于生产蛋白质产品,对于丁酸的大规模生产是不可持续的。因此,需要大量与食物无关的替代原料。目前已经有各种材料,包括食品工业、生物柴油工业的副产品(乳清、甘油等)和天然未利用生物质(淀粉、木质纤维素生物质、藻类生物质等)被视为生产丁酸的替代原料。乳清因含有糖、蛋白质和其它细胞生长所需的营养物质,是一种适合生产丁酸的原料。当以乳清为底物添加5 g/L酵母提取物时,丁酸发酵的性能明显增强,与没有添加酵母提取物的发酵相比,最终丁酸的浓度提高了1.88倍[19]。在以粗甘油为碳源、非无菌的条件下,Varrone等[20]研究了发酵混合微生物培养产丁酸的性能,最终丁酸的生产水平高达0.46 g(L·h),与初始的结果相比较提高了2.7倍。Reid等[21]直接利用淀粉生物质,如马铃薯淀粉和支链淀粉发酵合成丁酸。当使用木糖(14 g/L)、纤维素(14 g/L)和半乳糖(14 g/L)为碳源时,利用一种噬热放线菌muS-1产生了较高水平的丁酸(70.4 g/L)[22]。以玉米粉与蒸馏水配制经糊化和糖化处理的发酵培养基,发酵溶剂型丙酮丁醇梭菌,在产酸过程中可产生丁酸和乙酸,而主要的发酵产物为丙酮、丁醇和乙醇[23]。同时,也有研究表明,乳酸菌在含鱼类的MRS培养基中发酵,利用高效液相色谱法可检测到丁酸的产生[24]。

化学合成法为生产丁酸常用的方法,丙烯羰基合成法生产丁酸成本较高并且有副反应产生,产率降低,纯度不高。而正丁醛氧化法与新型工艺正丁醇氧化法则高效成本低,值得开发研究。同时,生物合成法生产的丁酸更加天然,应用于食品中更加健康安全。

2 丁酸的肠道生理功能

2.1 丁酸对肠道微生态及肠道黏膜的影响

2.1.1 丁酸对肠道微生态的影响 肠道内的丁酸菌可合成肠道丁酸,在生物合成反应中利用的主要生物酶为丁酰辅酶A和乙酸辅酶A转移酶。生物酶以乳酸为底物,避免了肠道内乳酸菌生物代谢积累过量的乳酸对肠黏膜造成破坏,从而维持肠道内微生态的平衡。酪酸梭菌产生丁酸,具有调节肠道内菌群平衡并重新建立平衡肠道微生态环境的功能。王爱华[25]在断奶仔猪、仔鸡的饲粮中加入丁酸钠后,发现其肠道细菌中乳酸杆菌的比例增大,大肠杆菌的比例减小,沙门氏菌对盲肠的感染率减少,即肠道菌群平衡有所改善。肠道微生态失调是腹泻的主要原因之一,丁酸可促进有益微生物增殖并且抑制有害微生物繁殖,从而改善肠道微生态平衡,在丁酸被利用的同时,也促进了钠、钾和水等对止泻有利物的吸收[26]。

2.1.2 丁酸对肠道黏膜的影响 丁酸一方面影响覆盖于结肠上皮黏液中的粘蛋白和TFFs(三叶因子)来提高肠黏膜的屏障能力,另一方面影响结肠上皮的通透性,增加肠道的屏障能力,减少炎症因子的产生,延缓溃疡性结肠炎或其它炎症。有试验表明[27],丁酸盐能够刺激人类结肠细胞系(LS174T)产生粘蛋白MUC2,而MUC2基因表达的增加促进了黏蛋白MUC2合成,加强了对黏膜层的保护。SCFA(短链脂肪酸)滴注法[28]表明,丁酸具有修复肠道黏膜的作用。大鼠模型进一步证实,丁酸的确能减轻实验性肠炎对黏膜的损伤[29]。Vieira等[30]给DSS(葡聚糖硫酸钠)诱导发生结肠炎的小鼠口服丁酸以后,发现丁酸可到达结肠,并抑制免疫细胞激活以缓解黏膜病变,从而缓解炎症损伤。Abdelqader等[31]研究了丁酸对热应激肉鸡性能、肠道组织学变化、有益肠道细菌计数和恢复反应的影响,发现热应激引起的肠道损伤与肠道相对重量的显著减少有直接关系,这可能表明,丁酸通过直接刺激增殖或抑制肠上皮细胞细胞凋亡,对黏膜恢复发挥积极作用。

2.2 丁酸对肠炎的影响

溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)是一种严重影响人类健康的炎症性肠道疾病,丁酸首先可激活GPRs(G蛋白偶联受体),受体主要包括GPR43、GPR41和GPR109A,还可激活过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferators-activated receptors gamma,PPARγ),从而激活其下游的信号通路,对炎症因子表达、免疫细胞的分化和迁移产生影响。丁酸与GPR结合后,激活丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路,影响炎症因子表达。其次,丁酸也可激活过氧化物酶体增殖物激活受体,促进紧密连接蛋白表达,保证肠道的屏障能力。最后,丁酸作为组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor,HDACI),还可以抑制NF-κB(核因子-κB)信号通路的激活、抑制炎症因子的表达、促进T细胞凋亡和肠道抗菌肽的分泌[32],丁酸抑制溃疡性结肠炎分子机制如图3所示。Cox等[33]发现,丁酸可通过Gpr43配体抑制由LPS(脂多糖)刺激的人单核细胞产生IL-1(白细胞介素-1)、肿瘤坏死因子、干扰素γ,且随着丁酸浓度越大,对炎症因子的抑制作用越强。敲除小鼠的GPR109A基因导致炎症反应加重,而丁酸的添加会使IL-6(白细胞介素-6)的表达量下降,IL-18(白细胞介素-18)的表达提高,同时促进了调节性T细胞的增殖。Singh等[34]研究发现,GPR109A(由Niacr1编码)是丁酸在结肠的受体,能够促进结肠巨噬细胞和树突细胞发挥抗炎症作用,并且能够使它们诱导调节性T细胞和产生IL-10(白细胞介素-10)的T细胞。另外,GPR109A在丁酸诱导结肠上皮细胞产生IL-18的过程中起着重要作用。上述研究证明,丁酸可以激活GPR影响炎症因子如IL-1、IL-6、IL-10、IL-18等的表达,从而缓解肠道炎症。由于调节性T细胞是有效的抗炎细胞,其产生与增殖一定程度对炎症产生影响。

图3 丁酸抑制溃疡性结肠炎分子机制示意图

2.3 丁酸对肠癌的影响

结直肠癌是指发生在人和动物大肠部位的恶性肿瘤,是一种最常见的恶性肿瘤。结直肠癌在癌症发病率中排名第三,在全球癌症死亡率中排名第四[35]。丁酸对结肠癌症细胞的主要作用是通过抑制细胞增殖,从而诱导细胞凋亡和细胞周期的停滞。丁酸能够诱导正常细胞隐窝基底细胞的增殖,提高健康组织的转化和维护效率,抑制癌细胞隐窝表面(潜在的肿瘤发育位点)细胞的增殖[36]。Ogawa等[37]研究表明,丁酸菌的代谢产物丁酸能发挥抑制癌细胞增生的作用,也能抑制因表皮生长因子诱导的细胞增生,同时下调环氧合酶,进而抑制人肠道微血管内皮细胞的血管生成,抑制癌细胞的生长。对人类结肠中丁酸盐和G蛋白偶联受体GPR109A之间的关系研究发现,丁酸盐与GPR109A的结合可以诱导结肠癌细胞的凋亡[38]。Daroqui等[39]的研究显示,丁酸盐可通过改变染色体结构、修饰组蛋白,抑制人结肠癌细胞中原癌基因c-myc、细胞周期蛋白的转录和表达,促进癌细胞凋亡。目前,丁酸抗肿瘤的理论已成功用于大肠癌的预防和溃疡性结肠炎的治疗中。

2.4 丁酸对肠道免疫调节的影响

在某种程度上,炎症性肠病是由免疫混乱引起的,而丁酸类代谢产物直接影响宿主的免疫应答,在调节溃疡性结肠炎免疫混乱中起到重要作用。NF-κB核转录因子在免疫调节和炎症反应中处于中心地位,丁酸抑制NF-κB信号途径和促进T细胞凋亡是其能够治疗UC(溃疡性结肠炎)的重要特性。丁酸可以抑制趋化因子的表达、抑制白细胞迁移,从而缓解炎症反应,体外试验表明,丁酸可以通过GPR43受体诱导中性粒细胞迁移[40]。Kvale等[41]通过对体外结肠上皮细胞株HT-29的作用研究,认为丁酸促进白细胞抗原-1(HLA-1)的表达,与IL-4(白细胞介素-4)、TNF(肿瘤坏死因子)、ICAM-1(细胞黏附因子-1)的分泌有关,而这些因子则可直接参与结肠细胞的免疫应答。丁酸盐可以通过诱导脾脏组织中PD-1/PD-L1信号通路的方式促进调节性T细胞的增殖,并在结肠组织中通过抑制巨噬细胞表面趋化因子受体和配体表达量的方式,对结肠组织中M1/M2型巨噬细胞数量的平衡进行调节[42],而M1/M2型巨噬从初始状态分化成具有特定免疫模式的状态,进而分别介导了肠道内各个类型免疫与炎症反应的平衡[43]。

丁酸作为一种短链脂肪酸对改善肠道微生态平衡、修复肠黏膜具有一定影响,对肠道疾病如肠炎、肠癌具有缓解作用,而对疾病的影响与丁酸对肠道的免疫调节相关。

3 结论与展望

由于在食品和药物中生物基绿色添加剂的需求日益增加,丁酸的微生物发酵法现已成为替代化学合成的方法。但工业发酵丁酸生产需要廉价的原料、高效的工艺性能、高纯度的产品和生产菌株的稳健性。所以通过基因工程方法以及优化发酵条件使丁酸发酵菌株产生高的丁酸产率有待研究。丁酸虽然对肠道微生态及肠道疾病有一定作用,但目前研究多借助单独培养的细胞研究,结合具体的动物模型或临床实验的报道很少,对丁酸作用肠道疾病作用机制的研究单一,还需大量实验全面考虑其对肠道疾病的作用机理。随着丁酸研究的进一步深入以及丁酸生理功能作用机制的进一步阐释,丁酸必将在保健、肿瘤预防与治疗等领域发挥更广泛的作用。