范 迪,张 宁,杨 燕,闻宏亮,秦 峰,刘 浩,范一灵

(上海市食品药品检验所,上海 201203)

肌醇广泛分布在动植物体内,是动物、微生物的生长因子。肌醇作为一种“生物活素”参与体内的新陈代谢活动。在医药领域中,肌醇可以作为药物治疗肝硬化、脂肪肝、糖尿病等疾病[1]。肌醇有9种同分异构体[2],其中具有光学异构体的D-手性肌醇[3]最值得关注,其广泛分布在荞麦、苦瓜等食物中,量少但具有类胰岛素作用[4],是当下研究的新领域。高等动物若缺乏肌醇,将会出现生长停滞和毛发脱落等现象,因此食用富含肌醇的食品对人体健康也是尤为重要。在食品领域中,肌醇存在于许多天然食品中,也常作为营养剂定量加入功能饮料、功能性乳粉等强化食品中。由于肌醇强化食品的食用人群通常包括婴幼儿及免疫力低下等特殊人群,肌醇的添加量与安全性息息相关,对其准确定量尤为重要。

目前国内外研究肌醇测定方法的文献主要集中于高效液相色谱法[5-6]、液相色谱-质谱法[7-8]、气相色谱法[9-10]、气相色谱-质谱法[11-12]和离子色谱法[13]等,而微生物法[14-17]是目前国标方法GB 5009.270-2016《食品安全国家标准食品中肌醇的测定》[18]中测定食品中肌醇的仲裁法,但其检测方法存在严重缺陷,选用的菌种酿酒酵母菌ATCC 9080无肌醇特异性,结果的重现性较差,无法准确定量测定。

因此,本研究在通常用于维生素含量测定的菌种中选取葡萄汁酵母菌及酿酒酵母菌各三株,重新筛选出肌醇特异性菌种,并比较市售干粉培养基及自配肌醇测定用培养基,对培养条件进行优化,以期建立测定食品中肌醇含量的微生物方法。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肌醇测定培养基 青岛日水生物科技有限公司、上海瑞楚生物科技有限公司、按配方成分实验室自配[18];麦芽浸粉液体培养基 上海瑞楚生物科技有限公司;肌醇标准品 SIGMA,LRAA9145,99.5%;葡萄汁酵母菌CICC1465、CICC31161、ACCC20202、酿酒酵母菌 CICC32249、CICC32919、ATCC9080、ACCC20065 中国工业微生物菌种保藏管理中心。乳粉 雅培益力佳SR营养配方粉;猪肉 爱森后腿精肉;薏米 上海忠缘弘食品有限公司;南瓜 上海欧尚超市有限公司;猕猴桃 新西兰佳沛绿奇异果,佳沃(青岛)果业有限公司;功能性饮料 红牛维他命饮料有限公司。

UV2450分光光度计 日本岛津公司;PYX-DHS-600-BS型恒温培养箱 上海贺德实验设备有限公司;SI-600R型振荡培养箱 Jeiotech公司;HV-110型压力蒸汽消毒器 Hirayama公司;酶标仪 美国BioTek公司;打碎机 耐欧;匀浆机 德国IKA公司。

1.2 实验方法

1.2.1 活化培养 将菌种冻存管接种到麦芽浸粉液体培养基中，于(30±1) ℃培养2～3 d增菌活化(晃动培养容器,至肉眼可见浑浊),再接种一环到麦芽浸粉琼脂斜面培养基上,于(30±1) ℃培养2～3 d后,制成贮备菌种,贮于4 ℃冰箱中,保存期不超过2周。临用前接种到新的麦芽浸粉琼脂斜面培养基上。

使用的前一天将贮备菌种转接到10 mL灭菌的麦芽浸粉液体培养基中,于(30±1) ℃培养20～24 h。取麦芽浸粉液体培养基培养物,在无菌条件下2000 r/min离心15 min,弃去上清液,加入10 mL已灭菌的生理盐水重新分散细胞,于旋涡混合器上快速混合均匀,离心15 min,倾去上清液。重复离心和清洗步骤三次。最后一次细胞分散液用生理盐水悬浮,制成混悬液,备用。用分光光度计,以氯化钠溶液作空白,550 nm波长下测定该接种菌悬液的透光率,调整加入的菌液量或者加入一定量的氯化钠溶液使该菌悬液透光率在60%～80%,尽快使用。

与现行食品安全国家标准中直接从麦芽浸粉琼脂斜面上制备菌悬液相比,本试验采用临用前从贮备菌种转接到麦芽汁肉汤,(30±1) ℃培养20～24 h的培养物来制备接种菌悬液,以此减少斜面洗菌过程中带入琼脂对后续处理过程中菌液浓度的透光率或吸光度测量造成的误差,提高实验准确度。

1.2.2 菌种筛选 使用酶标仪结合96孔板进行菌种在无肌醇添加的培养基(S2)以及添加最高浓度肌醇的培养体系(S10)中培养0～48 h,分析比较菌种生长的吸光度值随时间的变化情况。

1.2.3 培养基比较 通过酶标仪对市售肌醇测定用培养基以及实验室自配肌醇测定用培养基进行比较,对选定菌株分别使用1.1中三种肌醇测定用培养基,测定标准曲线浓度点的培养体系,在培养终点以标准曲线各浓度点吸光度平均值对浓度作图。

1.2.4 标准曲线

1.2.4.1 肌醇母液的配制 肌醇标准品置于五氧化二磷的干燥器中干燥24 h以上,精密称定50 mg(精确至0.1 mg)至250 mL容量瓶中,用二级水(后文提及的水均为二级水)溶解配制成0.2 mg/mL的肌醇标准储备液;吸取5 mL肌醇标准储备液至100 mL棕色容量瓶中,制成10 μg/mL的肌醇标准中间液;吸取20 mL肌醇标准中间液至100 mL容量瓶中,用水定容制成2 μg/mL的工作液。储备液与中间液于4 ℃冰箱保存,工作液需临用前配制。

1.2.4.2 标准曲线管的制作 取标准系列管S1～S10,每根试管加入肌醇测定培养基(青岛日水)5 mL,其中S3到S10分别加入2 μg/mL肌醇标准工作液0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5 mL,将S1～S10加水补足体积至10 mL。最终配制成S3～S10浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8和1.0 μg/mL的标准管,每个标准管一式三份。

1.2.4.3 灭菌及培养 每支试管内加入一粒玻璃珠(玻璃珠大小尽可能一致,防止菌种沉淀蓄积影响最终测定),盖上试管帽,121 ℃灭菌5 min。将上述试管冷却至30 ℃以下,除接种空白试管S1外,向其余各试管中滴加约150 μL CICC 1465菌悬液,加帽,涡旋混匀。将试管固定在振荡培养箱内,用约140～160 r/min振荡速度,在(30±1) ℃黑暗振荡培养约40～48 h。

1.2.4.4 标准曲线测定 经过培养后,未接种菌悬液的试管S1应是澄清的,否则结果无效。最高浓度标准管相隔2 h测定的吸光度差值小于2%即为培养终点。取出所有培养管,用S1作空白,读出S2的读数。再以S2作空白,调节吸光度为0,依次读出其他每支试管的吸光度。以肌醇标准系列的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标采用Logistic四参数拟合标准曲线计算试样中肌醇含量。超出标准曲线管范围的结果需舍去,每只试管测得的浓度不超过该编号试管浓度均值的±15%,超过亦舍去,符合要求的试管数不少于所有四个编号待测液总管数的2/3,否则需重新实验。

1.2.5 方法的应用

1.2.5.1 样品前处理 乳粉、薏米等需用研钵研磨、过筛(筛板孔径0.3～0.5 mm);猪肉用打碎机制成肉糜;南瓜、猕猴桃等试样需匀浆混匀;功能性饮料用前振摇混合。取含肌醇0.5～2.0 mg的试样,乳粉、猪肉约1～2 g,薏米、南瓜、猕猴桃及功能性饮料约5～10 g置于250 mL锥形瓶中,加入80～100 mL 0.44 mol/L的盐酸溶液混匀,以铝箔纸封口,在灭菌釜中125 ℃水解1 h。取出,冷却至室温,加入2 mL氢氧化钠溶液(600 g/L),冷却至室温,用10、1 mol/L的氢氧化钠溶液或1、0.1 mol/L的盐酸溶液调节pH至5.2,转入250 mL容量瓶中,定容至刻度。摇匀,过滤,收集滤液作为试样提取液。调整稀释度,使待测液肌醇的浓度在0.1～1.0 μg/mL范围内。

向待测液试管中加入水、试样提取液和肌醇测定培养基,从试管1到试管4分别加入试样提取液1、2、3、4 mL,培养基各5 mL,每根试管均加水补足体积至10 mL,每个浓度试管一式三份。灭菌及培养过程同标准曲线。

1.2.5.2 肌醇的计算 试样中肌醇含量计算公式:

式中:M为试样中肌醇的含量,mg/100 g;m为样品质量,g;Cx为根据标准曲线计算得的肌醇浓度(X)折算每支试管中加入的待测液体积获得肌醇含量所得的平均值,μg;f为样液稀释倍数。

1.3 数据处理

根据上述计算公式测得试样中的肌醇含量,标准曲线拟合采用ELISA软件的Logistic四参数方程并进行分析,数据结果偏差以RSD%表示。

2 结果与分析

2.1 菌种筛选结果

菌种筛选结果见图1,其中每一小格分别为相应菌种生长的吸光度值随时间(t/h)的变化情况。结果表明除CICC 32249和CICC 1465两株酵母菌,其余菌种的肌醇特异性均较差。因此,初步筛得CICC 32249和CICC 1465两株酵母菌,其生长对肌醇需求具有特异性。

图1 肌醇特异性菌株生长比较

由图1可知,CICC 1465在48 h内已经能够达到生长平台,而CICC 32249吸光度值仍在增长,还未达到生长平台。进一步比较酿酒酵母CICC 32249和葡萄汁酵母CICC 1465对于本方法的适用性。以肌醇对照品作为质控样品,分别以两株菌进行测定,见表1,CICC 32249实验测得的结果与理论值偏差达到25%以上,而CICC 1465实验测得的结果与理论值偏差小于8%,证明CICC 1465在微生物法中测定肌醇更准确,且生长时间较CICC 32249更短,因此最终选择葡萄汁酵母CICC 1465作为试验菌种。

表1 CICC 32249和CICC 1465的肌醇测定比较

2.2 培养基比较结果

如图2,结果表明以上三种培养基并无明显差异,因此本实验后续均选用市售青岛日水肌醇测定用培养基。

图2 肌醇测定用培养基的比较

2.3 标准曲线结果

本方法根据菌液吸光度与肌醇浓度的曲线关系,以肌醇标准系列的浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,运用ELISA软件采用Logistic四参数进行拟合，使曲线方程与标准管每一个浓度点更加契合,拟合效果优于线性等其他拟合方式,结果更准确,见图3。肌醇含量回归方程为:Y=(1.21585-0.0208)/[1+(X/0.3364)-2.96406]+0.0208,R2>0.996。其中,X为肌醇浓度,μg/mL;Y为吸光度值。曲线范围为:0.1～1.0 μg/mL。

图3 肌醇的标准曲线

2.4 方法学实验结果

2.4.1 精密度实验 将富含肌醇的功能性饮料、强化乳粉和天然食品猪肉、南瓜、猕猴桃、薏米各取平行样两份,分别配制成四个浓度梯度,每个浓度三份平行,按照1.2.5.1项下处理,测定肌醇含量,进行精密度实验,结果见表2。

表2 各基质中肌醇的精密度实验结果

强化肌醇的乳粉、功能饮料和天然食品中肌醇的含量,同一样品两份平行间相对偏差均小于2%,结果表明该方法的精密度良好,实验结果可靠。

2.4.2 重复性实验 称取适量样品,分别配制6份供试品,进行重复性实验,结果见表3,结果均在6%以内,表明该方法的重复性良好,实验结果可靠。

表3 重复性实验结果(n=6)

2.4.3 回收率实验及检出限 对六种基质的样品分别以1∶1进行加标回收,重复测定6次,计算平均回收率,见表4,结果均在94%～107%之间,RSD小于10%,回收率评价较好。

表4 加标回收率实验结果

通过对空白管重复测定20次得到方法的检出限为0.015 μg/mL,以取样1 g,定容至250 mL计,方法检出限为0.375 mg/100 g。

3 结论

本研究在原有国标方法的基础上,筛选出对肌醇特异性更强的菌种葡萄汁酵母菌(CICC 1465),相比此方法长久以来选用的葡萄汁酵母菌(ATCC 9080)具有创新性。通过优化后续试验条件对强化食品及天然食品进行肌醇含量检测,精密度相对偏差小于2%,重复性小于6%,回收率在96%～107%之间,方法学评价良好,结果准确可靠。方法检出限为0.375 mg/100 g,远低于现行国标检出限12.5 mg/100 g。可用于检测肌醇含量较低的食品,与其他检测方法复杂的前处理过程相比,微生物法具有操作简单,成本较低,灵敏度高等优点。本研究可以为食品安全国家标准的方法修订工作提供参考和支持。