张利平，黄振东，蒲占胥，鹿连明

(浙江省柑橘研究所，浙江 台州 318026)

柑橘黄龙病是柑橘产业上毁灭性的病害，由韧皮部难养杆状菌引起，病原菌有亚洲种(CandidatusLiberibacterasiaticus，CLas)、非洲种(Ca.L.africanus，CLaf)和美洲种(Ca.L.americanus，CLam)3个种，通过嫁接和木虱传播[1-5]；由于病原菌的侵入导致柑橘微观组织结构发生变化，感病叶片气孔凹陷萎缩，气孔周围组织变得粗糙不平整，栅栏组织细胞排列疏松、有较大的间隙；病株果蒂细胞变的大小不均匀，部分细胞皱褶扭曲变形，细胞间隙变大，果蒂的部分维管束堵塞[6]；由于病原菌的侵入导致柑橘代谢发生变化，甜橙染病后，地上部出现淀粉积累，地下部分则发生淀粉欠缺[7]，长链脂肪酸POA、OA、ALA、ARA降低[8]，同时植株激素也有变化，花后7和12个月的病果产生的乙烯减少，但在有症状果实花柱端、中部或茎端果皮中，IAA和ABA含量比无症状感病果实和正常果实高[9]，因此植株在感染病菌后，微观结构及微生态环境都有所改变。

植物内生真菌是全部生活史或者部分生活史在植物组织内且不会对植株造成不良影响的真菌。内生真菌与植物存在一个平衡点，一旦平衡被打破，内生真菌与植物的共生关系就会被打破[10]，植物体内的内生真菌种群有可能发生变化。本文以温州蜜柑为研究对象，研究了感染黄龙病柑橘植株的内生真菌的多样性及与健康植株的差异，旨在为黄龙病的防治及病理研究提供一定基础。现将有关试验结果总结和报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品采集

温州蜜柑黄龙病植株和健康植株均采自柑橘所橘园内，树龄均为20 a，采集结红鼻子果的橘树病株，健康植株是秋季结正常果实，且经过定量PCR鉴定为黄龙病菌为阴性的植株。分别采集病株和健康植株5株树，每株树上东南西北中5个方位采集叶片10片。

1.2 样品消毒分离与保存

采集的叶片自来水冲洗干净后，撕取叶片中脉，先在75%酒精中浸泡45 s，3%次氯酸钠溶液中浸泡3～5 min，然后75%酒精中浸泡45 s，无菌水冲洗5～6次，在超净工作台上无菌剪刀将叶片中脉剪成1 cm左右的小段，置于PDA培养基中，于28 ℃培养箱中培养，培养1周后出现菌落，切取菌落边缘纯化，经过多次纯化后得到纯的菌落，纯的菌落斜面保存于4 ℃冰箱。

1.3 真菌分子鉴定

1.3.1 DNA提取

刮取菌落表面菌丝于液氮中研磨，研磨后将100 mg粉末装于1.5 mL离心管中，利用TaKaRa MiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit试剂盒(Protocol-II)取真菌DNA。

1.3.2 PCR扩增及测序

引物为ITS1/ITS4/ITS5通用引物(序列为5-′TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′/5′-TCCTCCGCTTAT TGATATGC-3′/5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)；扩增体系是50 uL，包括PremixTaq(EX)酶25 μL、10 μm引物1，3 μL、10 μm引物2，3 μL灭菌水17 μL，真菌DNA 2 μL，设置阴性对照和阳性对照，阴性对照是清水做模板，阳性对照是已知真菌DNA。扩增程序依次是：95 ℃ 3 min，1个循环；95 ℃ 1 min，58 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，40个循环；72 ℃ 10 min，1个循环，重复3次。PCR产物直接送测序公司纯化测序，测序公司分别是赛默飞苏州测序部和宝生物大连生物工程有限公司，测序的仪器是ABI3730，测序为双向测序，得到的序列利用DNASTAR 7.1 Seqman拼接校对，校对后的序列在Blast比对，根据相似度确定种属，序列均提交到NCBI上。登录号见表1。

2 结果与分析

由表1可知，病株共分离到内生真菌21株，经鉴定隶属于11个属，其中炭疽菌属有9株，是优势菌群；轮层炭壳菌属和链隔孢属分别有2株，其他属均1株。健康植株共分离到内生真菌35株，经鉴定属于18个属，其中炭疽菌属有7株，光黑壳属和黑孢霉属分别有4株，炭角菌属和枝孢霉属分别有3株，小从壳属有2株，其他属均1株，感病植株的内生真菌数量和种类均少于健康植株，病株和健株都有炭疽菌属，且均为优势菌群，都有链隔孢属、半壳孢属(Leptostromasp.)和叶点霉属(Phyllostictacapitalensis)，病株有2株链隔孢属，健株有1株。

表1 柑橘健康植株和病株内生真菌比较

3 讨论

内生真菌与寄主是互惠共生的关系，有些内生真菌可以促进植物营养吸收，有些可以提高植物抗生物逆境和非生物逆境的能力，有些内生真菌可刺激植物产生活性物质等[10]。柑橘植株感染黄龙病后在基因转录水平、蛋白质水平、代谢水平及显微结构上发生了一系列变化，淀粉在带病成熟叶中大量积累，基因DPE2和MEX1被下调表达，这两个基因与淀粉分解代谢相关，蛋白表达也有差异，几丁质酶、Cu/Zn超氧化物歧化酶、脂氧合酶和4个miraculin类似蛋白在感病甜橙叶片样品中表达提高3.6～13.7倍[11]；柑橘体内的内生真菌当植株感染黄龙病后对植株有什么影响，是变成了致病菌还是在帮助植株对抗黄龙病菌，植物启动的应答反应是不是也有内生真菌参与其中，这些有待于进一步研究。