庞 静，王 健，王晓云，韩 笑，刘凯娜，郭金颖

（秦皇岛市食品药品检验中心，河北 秦皇岛 066000）

牛黄上清丸为甲类OTC，1977至2015年版《中国药典》均有收载，处方来源于明代李梃《医学入门》牛黄上清丸加减方，由人工牛黄、薄荷、菊花、荆芥穗、白芷、川芎、栀子、黄连、黄柏、黄芩、大黄、连翘、赤芍、当归、地黄、桔梗、甘草、石膏、冰片十九味药组成，具有清热泻火，散风止痛的功效。用于热毒内盛、风火上攻所致的头痛眩晕、目赤耳鸣、咽喉肿痛、口舌生疮、牙龈肿痛、大便燥结。牛黄上清丸处方中人工牛黄性凉，是清热解毒之佳品，为君药[1-2]。胆酸和胆红素是人工牛黄的主要成分，且胆红素是评价人工牛黄质量优劣的重要指标性成分[3-5]，现行的质量标准[1]仅对胆酸、猪去氧胆酸进行了薄层色谱鉴别质控，无胆红素控制方法。有文献报道采用比色法、分光度法、薄层色谱法、高效液相色谱法等测定人工牛黄（牛黄）药材或一些制剂中胆红素的含量[6-13]，另有牛黄上清片中胆红素含量测定方法[14-15]的报道，在参考已有文献的基础上，本文采用高效液相色谱法测定牛黄上清丸中胆红素的含量，方法准确、可靠，可用于牛黄上清丸的质量控制。

1 仪器与试药

1.1 仪器

LC-20AHT型高效液相色谱仪（日本岛津），AG-135型十万分之一电子天平（Mettler Toledo），DL-1028H型超声波清洗器（Bandelin），TDL-60B型低速台式离心机（上海安亭科学仪器厂），Super型漩涡混合器（德国爱安姆科技有限公司）。

1.2 试药

胆红素对照品（中国食品药品检定研究院，批号100077-200805，含量98.5 %）；牛黄上清丸样品（均为大蜜丸）由1～9药厂提供；乙腈（MREDA，USA，色谱纯），水为超纯水，草酸、二氯甲烷、冰醋酸均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 对照品溶液制备 精密称取胆红素对照品10.56 mg，置100 ml量瓶中，用二氯甲烷溶解并稀释至刻度，摇匀，再精密量取上述溶液3 ml，置50 ml量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即得6.2410 μg/ml的对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液制备 取本品约3 g，剪碎，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入10 %草酸溶液10 ml，水饱和二氯甲烷15 ml，称定重量，涡旋混匀，超声处理（功率500 W，频率35 kHz）30 min，再称定重量，用水饱和二氯甲烷补足减失的重量，摇匀，离心（4000 r/min）3 min，分取二氯甲烷液，滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性对照溶液制备 按照处方，取人工牛黄以外的18味中药材适量，按照质量标准[1]中[制法]项依法操作，制成大蜜丸，并按2.1.2项下方法制备阴性对照溶液。

2.2 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Wondasil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-1 %冰醋酸溶液（95:5）；流速1.0 ml/min；检测波长450 nm；柱温25 ℃；进样量10 μl。理论塔板数按胆红素峰计算均大于6000，色谱峰分离度良好。色谱图见图1。

图1 对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液的HPLC色谱图

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液0.25，0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 ml分别置10 ml量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，即得不同浓度的系列对照品溶液。按2.2项下色谱条件分别进样，测定峰面积，以浓度（μg/ml）为横坐标（X），峰面积（Y）为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y=4 928 096X+751.38，r=0.9999（n=6）。胆红素浓度在0.1560～1.560 μg/ml范围内线性关系良好。

2.3.2 精密度 取2.1.1项下对照品溶液，精密量取1.5 ml置10 ml的量瓶中，加二氯甲烷稀释至刻度，摇匀，按2.2项下色谱条件连续进样6次测定峰面积，峰面积RSD为0.68 %，表明仪器精密度良好。

2.3.3 重复性试验 取同一均匀样品（批号5010066），平行取样6份，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件分别进样测定。结果胆红素平均含量为4.5609 μg/g，RSD为0.96 %，表明该方法重复性良好。

2.3.4 稳定性考察 取同一供试品溶液，分别于0，4，8，10，12 h进样测定，记录峰面积，结果胆红素峰面积RSD为1.11 %，表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。

2.3.5 加样回收率测定 精密称取已知含量（批号5010066，含量：4.5609 μg/g）的供试品9份，每份约1.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，制备3个浓度的供试品溶液，每个浓度平行制备3份，分别按供试品含量的50 %，100 %，150 %加入按2.1.1项下方法配制的胆红素对照品溶液（6.2410 μg/ml）0.5，1.0，1.5 ml，按2.1.2项下方法自“精密加入10 %草酸溶液10 ml……”起，制备供试品溶液，按2.2项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算回收率。结果表明，胆红素的平均加样回收率为100.00 %，RSD为1.27 %（n＝9），本方法回收率较好。见表1。

表1 胆红素加样回收率测定结果

2.4 样品测定

取不同厂家的9批次的牛黄上清丸，按2.1.2项下方法制备供试品溶液，并按2.2项下色谱条件测定含量，测定结果见表2。

表2 胆红素含量测定结果

3 讨论

3.1 试验中注意事项

据文献报道[15]，因丸剂中含有蜂蜜，妨碍胆红素溶出，且丸剂中胆红素含量较低，在样品处理过程中操作繁琐，提取浓缩时间较长，又因胆红素对光[16]、热均不稳定，易造成含量结果偏低，所以在试验过程需避光操作、快速提取且选择了较低的色谱柱温度。

3.2 含量测定结果分析

2015年版《中国药典》（一部）要求人工牛黄中胆红素的含量不得低于0.63 %，按此含量及处方量计算，牛黄上清丸中最少应含有胆红素7.0460 μg/g。采用本方法，测定了9个不同厂家的牛黄上清丸中胆红素的含量，结果胆红素的含量范围为1.8262～6.3945 μg/g，转移率分别为69.9 %，54.8 %，72.6 %，20.7 %，23.9 %，23.5 %，24.7 %，55.0 %，51.8 %，不同厂家胆红素含量差异较大，所以检测牛黄上清丸中胆红素的含量很有必要。

3.3 流动相的选择

本试验比较了甲醇-乙腈-0.1 %磷酸、甲醇-1 %冰醋酸、乙腈-1 %冰醋酸系统的分离效果，结果以乙腈-1 %冰醋酸（95:5）为流动相时，胆红素峰形良好且阴性无干扰。

3.4 提取方法的选择

供试品溶液制备过程中，使用三氯甲烷超声处理，结果含量偏低且平行样品之间含量差异较大，后使用10 %草酸溶液、水饱和二氯甲烷，涡旋混匀，超声处理进行提取，离心取样[1，9]，得到较好结果。

3.5 提取时间的选择

对超声提取的时间进行了考察，比较了20，30，40 min，试验结果表明，超声30 min提取效果最好。