鄢 磊 张雪瑞 曹东华

（1 大连市妇幼保健院遗传代谢实验中心，辽宁 大连 116001； 2 大连市妇幼保健院遗传代谢中心，辽宁 大连 116001）

流产是指孕妇怀孕不足28周、胎儿体质量低于1 kg而导致妊娠过程终止，在产科中极为常见。自然流产，是指在多种共同病因影响下未采用人工方式而导致妊娠终止的流产，占流产的10%～15%[1]，自然流产的病因复杂，但半数以上的自然流产均为胚胎染色体异常，其他还有母体免疫因素、宫内感染等等。荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）是采用非射性技术对流产所分泌出的组织进行DNA的定性、定量或相对定位分析，其具有操作简便、分析快速、准确度高等优点，能为自然流产的病因的诊断提供较为准确的理论依据[2]。本院自2014年开展荧光原位杂交技术以来，取得不俗的效果，现将其应用过程报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选取2014年1月至2017年12月在我院自然流产检查的240例绒毛组织。孕妇年龄范围为18～44岁，平均年龄（28.3±3.5）岁；年龄大于35岁孕妇有98例，年龄小于35岁孕妇有142例；流产次数在3次（包含3次）以上者80例，流产次数在3次以下者有160例。本次研究内容均告知孕妇及家属，取得其同意后进行。

1.2 方法：①标本收集及处理：取待检对象的绒毛组织，去除蜕膜、血块等杂质后，剪碎后进行离心，60%冰乙酸用力吹打1min消化，去掉上清液以后进行滴片（去除上清液以后须加一定量的固定液方便滴片），滴片完成于室温下保存24 h方进行下一步操作。②玻片预处理及变性杂交：室温下将玻片置于中性SSC溶液中进行漂洗，时长为5 min，其后采用胃蛋白酶进行消化，并再次将玻片置于中性SSC溶液中进行漂洗；其后按照70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇的顺序将玻片进行脱水（时长均为3 min），其后10 μL探针混合物滴加于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边；杂交仪共变性，共变性条件：75 ℃，5min，杂交条件：42 ℃，16 h。③共变性后处理及检测：上述处理完成后，将载玻片上的盖玻片移出，其后放入46 ℃的生理盐水水浴锅中将玻片进行漂洗，漂洗时长为10 min，漂洗过程中注意对玻片进行振荡；上述步骤完成后将玻片置于46 ℃水浴锅（水浴锅为0.1% NP-40/2×SSC溶液）进行漂洗，漂洗时长为10 min，漂洗过程中注意对玻片进行振荡；上述步骤完成后将玻片置于70%乙醇中进行漂洗，漂洗时长为5 min。其后取出玻片将玻片进行风干；玻片风干后，将15 μL DAPI 复染剂加至目标区域，立即盖上盖玻片，暗处放置10～20 min后观察组织的染色体情况。④试剂：本次选用的FISH试剂盒为金菩嘉试剂盒，购于北京金菩嘉医疗科技有限公司（国食药监械字2012第3400283号），主要包括GLP13/GLP21（绿/红标记）、GLP16/GLP22（红/绿标记）、CSP18/CSP X/CSP Y（蓝/绿/红标记）。

1.3 诊断标准：所选取的样本中，其细胞计数须大于100个，当检测到异常多于60%时即视为阳性，低于10%视为阴性，在10%～60%为嵌合体。

1.4 统计学方法：本次研究所有数据的处理均采用SPSS20.0处理，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本t检验。组内不同时间点的比较采用重复测量设计的方差分析。计数资料用频数和率表示，组间比较采用χ2检验。检验标准α=0.05，当P＜0.05表示有统计学意义。

2 结 果

在240例自然流产的绒毛组织中，检出染色体异常共计110例，异常率为45.83%。异常分布类型见表1。在高龄妊娠和非高龄妊娠孕妇中，异常率比较无差异（P＞0.05）。见表2。在反复流产与非反复流产孕妇中，其异常率比较无差异（P＞0.05）。见表3。

3 讨 论

随着生活模式的转变，近年来，流产率尤其是自然流产人数，越来越高。导致自然流产的原因是多种多样的，包括免疫因素、感染、内分泌异常以及其他未知因素，但最为重要的仍然是染色体异常[3]。染色体异常又以13、18、21、X和Y染色体异常占多。绒毛细胞为在胎盘和子宫壁之间的接触面上，密生的指状或树枝状小突起的细胞团，其与胎儿具有相同的染色体类型，因此绒毛组织是对胎儿染色体异常进行诊断的重要物质基础。

表1 FISH检测结果分布

表2 高龄孕妇与非高龄孕妇异常率比较

表3 反复流产孕妇与非反复流产孕妇异常率比较

绒毛组织通常在自然流产胎儿停止发育后由阴道娩出，因此绒毛组织常常被污染，对于普通方法提取绒毛组织染色体而言具有难度且易被干扰。FISH是一种能够快速检测组织染色体的技术，其主要原理为通过荧光素将特制的染色体探针进行标记，这些探针特异性识别染色体并与之结合，结合后这些荧光素能将染色体显影出来，对于染色体数目异常具有良好的诊断效果[4]。本次发现，对240例绒毛组织显影发现，有110例绒毛组织出现了异常，异常率为45.83%，与以往文献报道相差不大[5]，同时在这些异常中16-三体、X单体异常所占比例最多。

本次研究还比较了高龄孕妇（大于35岁）与多次流产（3次以上）的异常率，发现高龄孕妇与非高龄孕妇之间的异常率并无差异，而多次流产与非多次流产孕妇之间异常率也无差异。提示孕妇自然流产次数、孕妇年龄与胚胎染色体异常的发生率无明显相关性。

综上所述，荧光原位杂交技术在对由染色体异常导致的自然流产的检测中，具有准确度高、操作简便等特点，能为快速诊断自然流产的病因提供准确的理论依据。