周祖莲， 赵通武， 李玉华， 冉思成， 姜安雅

(重庆市黔江中心医院肾内科， 重庆 409099)

免疫球蛋白A肾病(IgA nephropathy，IgAN)是慢性肾疾病和肾衰竭的主要因素之一[1]，同时也是原发性肾小球疾病中最常见的一种疾病类型[2]。在中国，IgAN病人在20年内发展为肾衰竭的比例高达36%[3]。同时，患有未知原发性肾疾病的患者在肾移植后会出现IgAN并发症[4]。因此，深入探讨IgAN发病机理，对IgAN及其相关疾病现有的治疗手段的补充和扩展具有重要的临床意义。

免疫系统的激活以及炎症反应是包括IgAN在内的慢性肾疾病的主要病因之一[5]。IgAN最核心的致病因素即为循环中以半乳糖缺乏的IgA为主的免疫复合物形成后沉积于肾小球系膜区域，从而导致系膜机制扩张和肾小球纤维化[6]。临床观察显示IgAN患者中通常存在半乳糖缺乏的IgA和IgA复合物的增加，这种现象部分可以归结为B细胞过度产生IgA所致[7-8]；除此之外，也有报道显示IgA和IgA复合物的清除障碍也是原因之一[9]。但是，关于诱发IgA产生的因素以及IgA的产生部位至今还不明确，因此，现在依然没有特异性针对这种病理因素的治疗手段来干预该疾病的发生与发展[5, 10]。面对这种现状，需要我们对其发病机理以及干预手段进行更深入的了解。

Toll样受体(Toll-like receptor，TLR)信号通路在IgAN的发生和发展中扮演着重要的角色[11]。最近研究发现匹多莫德(pidotimod)可以抑制TLR信号介导的炎症反应[12]。匹多莫德是一个人工合成的二肽小分子，在动物和人类样本中的研究都发现它对固有免疫以及适应性免疫具有广泛的调节作用[13]。因此，本研究中我们探讨匹多莫德是否可能通过抑制炎症反应影响IgAN的进程，从而为IgAN的治疗提供更多的临床前实验证据。

材 料 和 方 法

1 实验材料

牛丙种球蛋白(bovine gamma globulin,BGG)购于北京百奥莱博科技有限公司；RNAiso Plus试剂购于TaKaRa；抗IgA抗体购于Southern Biotech；蛋白裂解液购于江苏碧云天生物公司；BCA蛋白定量试剂盒及抗白细胞介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和IL-6抗体购买于Thermo Fisher Scientific；实验用引物由上海吉玛公司合成。

2 实验方法

2.1实验动物和IgAN模型的制作与分组 40只6周龄，SPF级健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，体重为180～200 g，购自于上海斯莱克实验动物有限公司，许可证号为SCXK(泸)2017-0005。4只用于预实验IgAN大鼠模型练习，不纳入实验统计。36只SD大鼠，随机均分为正常对照(control)组、模型(model)组、强的松(prednisone)组和匹多莫德(pidotimod)组，每组9只。IgAN大鼠模型制造方法参考文献[14]，大鼠连续给予含有0.1% BGG的6 mmol/L HCl溶液作为饮用水。8周后，大鼠连续3 d尾静脉注射给予1 mg BGG(溶解于6 mol/L HCl溶液)。正常对照组不做任何处理，给予自由饮水和食物；模型组在IgAN模型制作后，给予自由饮水和食物；强的松组的IgAN模型大鼠按照10 mg·kg-1·d-1的剂量进行灌胃作为阳性对照组；在匹多莫德组，以无菌蒸馏水配制匹多莫德溶液，按10 mg·kg-1·d-1的剂量对IgAN模型大鼠进行腹腔注射。以上各处理组的治疗时间均为4周。处理结束后采集样本进行后续实验。

2.2样品采集和肾功能生化指标的分析 将各处理组大鼠在12周末放置于代谢笼中收集24 h内尿液，同时进行股动脉采集血样；样本均保存于-20 ℃。血清肌酐、尿蛋白和血尿素氮等指标使用Beckman自动分析仪进行检测。

2.3RT-qPCR检测转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、纤连蛋白1(fibronectin 1)、IL-1β和IL-6的mRNA表达水平 取0.1 g肾皮质区样本置于匀浆器内，加入1 mL RNAiso Plus试剂(TaKaRa，货号9108)，匀浆后置于1.5 mL离心管中，按照试剂说明书提取总RNA。以50 μL DEPC水溶解后利用NanoDrop 2000测定RNA浓度。以1 μg RNA通过逆转录反应，获得cDNA。将获得的cDNA按照实时定量PCR试剂盒说明书进行后续操作以检测各基因表达情况。以β-actin为内参照，按照2-ΔΔCt法计算相应基因的表达量。该实验使用引物序列见表1。

表1 RT-qPCR实验所使用引物

2.4免疫荧光检测肾组织内IgA的沉积 各处理组肾组织经过石蜡包埋切片，组织样本厚度大约为4 μm。利用二甲苯脱蜡2次，每次10 min。之后依次使用无水乙醇-95%乙醇-80%乙醇-70%乙醇-ddH2O-ddH2O-ddH2O进行复水，每次3 min。最后利用0.3%H2O2处理切片10 min以消除内源性过氧化物酶活性。经过抗原修复冷却至室温后，利用FITC标记的IgA抗体4 ℃孵育过夜，次日经洗涤后利用尼康激光共聚焦显微镜进行成像。

2.5Western blot检测 IL-1β和IL-6蛋白在肾组织的表达水平 利用蛋白质裂解液从各处理组肾皮质区提取总蛋白质。按照BCA试剂盒说明书对蛋白质浓度进行定量。取50 μg蛋白质样品，加入上样缓冲液后在沸水中煮5 min以使蛋白质充分变性。15% SDS-PAGE分离目的蛋白质，之后用湿转法转移至PVDF膜。5%脱脂奶粉室温封闭1 h后加入稀释过后的I抗4 ℃孵育过夜，次日经过TBST洗涤后加入相应II抗室温孵育1 h。再次洗涤后利用化学发光法进行显影成像。

3 统计学分析

本实验定量资料均采用均数±标准差(mean±SD)进行描述，并使用软件GraphPad Prism进行统计学分析和作图。对于多组定量资料的比较采用单因素方差方法进行分析。以P<0.05为差异具有统计学意义。

结 果

1 匹多莫德对IgAN模型大鼠肾功能的影响

各处理组大鼠在12周末时进行体重和一般肾功能生化指标测定，结果显示，4组大鼠体重的差异无统计学显著性，见图1A。在IgAN模型组大鼠中尿蛋白、血清肌酐和血尿素氮升高(P<0.01)；相对于模型组，给予强的松或者匹多莫德治疗后大鼠的尿蛋白、血清肌酐和血尿素氮均显著降低(P<0.01)，见图1B～D。

Figure 1. The effect of pidotimod on the body weight and biochemical indicators of the rats in different treatment groups. A: no significant difference of the body weight was observed in the 4 groups; B, C and D: pidotimod reversed the increased levels of urine protein, serum creatinine and blood urea nitrogen in the IgAN rats. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

图1 匹多莫德对IgAN模型大鼠体重和生化指标的影响

2 匹多莫德对IgAN模型大鼠肾组织中IgA沉积的影响

组织免疫荧光法对IgA的沉积进行观察的结果显示，在正常对照组只有极少量IgA沉积，而IgAN模型大鼠肾组织中IgA沉积显著增多(P<0.01)，但给予强的松或者匹多莫德治疗后，IgA沉积明显减少(P<0.01)，见图2。

Figure 2. Pidotimod inhibited IgA deposition in the IgAN rats (×400). Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

图2 匹多莫德抑制IgAN模型大鼠肾组织中IgA沉积

3 匹多莫德对IgAN模型大鼠肾纤维化的影响

用RT-qPCR方法对各处理组肾组织中纤维化标志物TGF-β1和fibronectin 1的mRNA表达水平进行检测，结果显示，在IgAN模型组，TGF-β1和fibronectin 1的mRNA表达水平分别较正常对照组显著增多(P<0.01)；而在强的松或者匹多莫德治疗组，两者的表达水平均显著下降(P<0.01),见图3。这一结果提示匹多莫德可以有效缓解IgAN的病理发展。

Figure 3. Pidotimod alleviated renal fibrosis in the IgAN rats. The expression levels of renal fibrosis markers were detected by RT-qPCR. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

图3 匹多莫德抑制IgAN模型大鼠肾组织中纤维化标志物TGF-β1和fibronectin 1的mRNA表达水平

4 匹多莫德对IgAN模型大鼠肾组织中炎性细胞因子表达的影响

提取各个处理组肾组织样品，分别对IL-1β和IL-6在mRNA和蛋白水平的表达进行分析，结果显示，IgAN模型组大鼠的IL-1β和IL-6表达在mRNA和蛋白水平均明显增加，且和正常对照组的表达量相比差异具有统计学意义(P<0.01)；而强的松或者匹多莫德治疗4周后均可以抑制上述炎性细胞因子在mRNA和蛋白水平的表达(P<0.01)，见图4。这一结果提示匹多莫德可以通过调控炎症反应减轻IgAN症状。

Figure 4. Pidotimod inhibited the production of IL-1β and IL-6 both at mRNA (A) and protein (B) levels. Mean±SD.n=9.**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsmodel group.

图4 匹多莫德抑制IgAN模型大鼠肾组织中炎性细胞因子 IL-1β和IL-6的表达

讨 论

本研究中匹多莫德可以有效改善IgAN模型大鼠的病理症状，比如减少蛋白尿的产生，抑制IgA的沉积，阻碍肾纤维化的进程。本研究的发现为匹多莫德应用于IgAN的治疗提供了实验基础，也为IgAN患者能够持续使用免疫抑制剂提供了一定的依据。

大量研究表明炎症反应在IgAN的发生和发展过程中扮演着重要的角色[15]。IgAN患者中常伴有C-反应蛋白等炎性标志物的增加。且有证据表明在IgAN患者中IL-1β和IL-6等促炎细胞因子的增加与病患的预后密切相关[16-17]。我们的研究发现IgAN模型大鼠肾皮质区域IL-1β与IL-6的表达在mRNA水平和蛋白质水平均有增加；而在给予匹多莫德治疗后，可以抑制IgAN诱导的促炎细胞因子IL-1β、IL-6的表达。我们的研究初步表明匹多莫德对IgAN的保护作用可能是通过抑制炎症反应介导的。

匹多莫德自从被发现以来在临床中的应用一直集中于对儿童急性呼吸道感染疾病的防治中；且最近的临床试验表明匹多莫德对于儿童反复呼吸道感染也具有一定的疗效[18]。鉴于匹多莫德对固有免疫和适应性免疫的多重作用，它是否通过其他途径影响了IgA肾病的病理进展有待我们进一步分析。总而言之，我们发现匹多莫德可以通过抑制IL-1β与IL-6促炎细胞因子的表达，降低纤维化标志物TGF-β1和fibronectin 1的表达，从而减缓IgA肾病的发展，从而为IgA肾病的临床治疗提供可能的新型治疗方法，也为丰富匹多莫德的临床使用提供了一定的理论基础。