张 婧，贡松松，吴剑平，潘 娟，王 博，严 凤

(上海市兽药饲料检测所，上海 201103)

现代畜牧养殖业的发展离不开抗生素。兽用抗生素的合理使用可以预防、治疗动物疾病，促进和维持动物的健康生长[1]。但一些不法商贩受经济利益驱使，在饲料中蓄意添加禁用抗生素等风险物质，不仅影响畜禽的正常生长，而且给畜禽产品质量带来了安全隐患[2]。多年来，农业农村部一直强调建立以质量安全为核心的饲料工业标准体系，强化饲料兽药等投入品的风险管控，提升畜产品质量安全的保障能力。自2002年起陆续颁布了农业部第176号公告《禁止在饲料和动物饮用水中使用的药物品种目录》，第193号公告《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》以及第1519号公告《禁止在饲料和动物饮水中使用的物质》等[3-5]。因此，各类公告中禁止或限量使用的各种抗生素及其他化合物的检测一直是畜产品质量安全的重要保障。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

乙腈、甲醇(色谱纯，美国Merck 公司)；甲酸(色谱纯，美国Tedia公司)；实验用水为超纯水(Milli-Q超纯水系统自制)。

74种抗生素及其他化合物的标准品购自德国Dr.Ehrenstorfer公司、德国Witega公司、美国Sigma公司、中国药品生物制品检定所、中国兽医药品监察所和天津阿尔塔有限公司。标准品纯度为88.6%～99.8%，相关信息如表1所示。

Q-Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱配H-ESI Ⅱ 源、Ultimate 3000液相色谱系统及Trace Finder数据处理系统(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。

1.2 标准溶液的配制

称取10 mg标准品(根据纯度折算质量)，用甲醇或50%乙腈等合适的溶剂溶解并定容至10 mL，制成1 mg/mL的单标储备液。对于每类化合物，将单标溶液混合配制成50 μg/mL或100 μg/mL的混合标准溶液，使用时再根据需要混合或稀释。所有标准储备液均置于4 ℃下避光保存。

1.3 仪器条件

1.3.1 液相色谱条件色谱柱:Agilent SB C18柱(3.0 mm×100 mm，1.8 μm),流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为0.1%甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序：0～15.0 min，5%～95%B；15.0～17.0 min，95%B；17.0～17.5 min，95%～5%B；17.5～21.0 min，5%B；流速：0.3 mL/min；柱温：30 ℃，进样量：10 μL。

1.3.2 质谱条件可加热的电喷雾离子源(HESI-Ⅱ)，离子传输管温度：325 ℃，毛细管电压：3 200 V(正、负离子切换模式)，气化温度：350 ℃，鞘气(N2)：40 L/min，辅助气(N2)：10 L/min，一级质谱驻留时间：100 ms，二级质谱驻留时间：50 ms，一级全扫描范围：m/z100～1 200，分辨率(R)：70 000，扫描模式：Full scan+dd MS2，碰撞裂解气：高纯氮气，碰撞能量：20、40、60 eV。母离子及子离子的精确分子量见表1。

1.4 样品前处理

猪尿样品经9 000 r/min离心3 min后，精密移取200 μL，用0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈溶液(95∶5，体积比)稀释至1 mL，待测定。

2 结果与讨论

2.1 前处理方法的优化

待测药物种类多，且各药物的理化特性各异。因此，样品前处理方法需具有普适性，且尽量简化前处理步骤，以减少目标化合物的损失。PRiME HLB和EMR-Lipid固相萃取法均为通过式固相萃取法，萃取柱无需活化和平衡，样品净化过程简单、快速、有效，近几年被逐渐应用于兽药残留检测领域[21-22]。由于尿样基质相对简单，实验对比了直接稀释法、乙腈提取后经PRiME HLB固相萃取和EMR-Lipid固相萃取3种前处理方法。其中，直接稀释法是将样品经高速离心后直接用初始流动相稀释5倍进样分析。后两种固相萃取法是取2 mL尿样加入18 mL乙腈提取，过PRiME HLB(3 mL)或EMR-Lipid(3 mL)固相萃取柱后，取1 mL以氮气吹干，用0.5 mL初始流动相复溶后上机测定。结果表明，直接稀释法对74种药物的提取效果最好，尤其是对四环素类及喹诺酮类药物提取时损失很小。因此，选用直接稀释法对猪尿样品进行前处理。同时，为减少药物过滤膜时的损失，样品经高速离心并稀释后直接进样。

2.2 筛查与确证方法研究

根据欧盟法规2002/657/EC[23]，以识别分(IPs)为指标对化合物进行定性分析，对于不同法规要求的残留物，确证所需的IPs各不相同。确证指令96/23/EC[24]附录I-A组所列的物质(即违禁化合物)，最少需要4个识别点；确证附录I-B组所列的物质(即限用化合物)，最少需要3个识别点。不同质谱技术的IPs亦各不相同，针对高分辨质谱(分辨率大于10 000)，需要1个母离子与1个子离子即可满足4个识别点，其中1个母离子为2.0 IPs，对应的1个子离子为2.5 IPs。此外，美国食品药品监督管理局(FDA)陆续发布了关于兽药残留检测的指导准则FDA-CVM GFI #118号法规[25]，针对兽药残留的筛查确证指南[26]，以及关于食品和饲料中农药残留分析的质量控制和方法验证程序导则FDA-SANTE/11813/2017[27]。其中对精确质量数偏差作出了规定，确证条件为至少需要1对合适的母离子与子离子，母离子的精确质量数偏差≤5 ppm，子离子的精确质量数偏差≤10 ppm。

按照上述原则和仪器方法，对目标药物单标溶液进样测定并建库分析，获得母离子的精确质量数、保留时间及其二级碎片离子的全扫描图谱，找出丰度最高的子离子和母离子作为确证所需的定性离子对。以74种药物的保留时间、母离子及子离子的精确质量数作为定性依据，具体见表1。

表1 74种目标药物的保留时间(RT)、母离子及子离子的精确质量数Table 1 Retention times(RT),parent ions and fragment informations of 74 targeted compounds

(续表1)

No.CategoryChinesenameEnglishnameRT(min)Parention(m/z)Fragment1(m/z)Fragment2(m/z)Fragment3(m/z)18磺胺硝苯Sulfanitran9.33336.06487294.05430198.02194156.0113719磺胺苯吡唑Sulfaphenazole8.42315.09102222.03317158.07127108.0443920磺胺吡啶Sulfapyridine5.24250.06447184.08692156.01138108.0443921磺胺喹啉Sulfaquinoxaline8.22301.07537156.01138108.0443992.0494822磺胺噻唑Sulfathiazole5.11256.02089156.01138108.0443992.0494823磺胺二甲基异嘧啶Sulfisomidine4.25279.09102156.01138124.08692108.0443924磺胺异唑Sulfisoxazole7.61268.07504156.01138113.07094108.0443925甲氧苄啶Trimethoprim4.98291.14517275.11387261.09822245.1033026Tetracyclines4-差向脱水四环素4-Epianhydrotetracycline7.10427.1499898.06004239.07030321.0757027(四环素类,8种)4-差向四环素盐酸盐4-Epitetracyclinehydrochloride5.10445.16054410.12343201.0910198.0600428金霉素Chlortetracycline6.60479.12157462.09502444.08446154.0498729去甲基金霉素Demeclocyclin5.59465.10592448.07937430.06881154.0498730多西环素Doxycycline6.32445.16054428.13399321.07575267.0651831土霉素Oxytetracycline5.15461.15546426.11834337.07066283.0601032四环素Tetracycline5.50445.16054410.12343154.0498798.0600433美他环素Methacycline6.56443.14489426.11834201.05462-34Quinolones西诺沙星Cinoxacin7.27263.06625235.07133217.06077207.0400335(喹诺酮类,15种)环丙沙星Ciprofloxacin5.17332.14050288.15067245.10847231.0928236达氟沙星Danofloxacin5.00358.15615314.16632283.12412257.1075037双氟沙星Difloxacin5.70400.14672356.15689299.09905-38依诺沙星Enoxacin4.60321.13575277.14592257.13969234.1037239恩诺沙星Enrofloxacin5.66360.17180316.18197245.10847203.0615040氟罗沙星Fleroxacin4.80370.13730326.14747269.08962-41氟甲喹Flumequine9.40262.08740244.07683220.04045-42洛美沙星Lomefloxacin5.00352.14672308.15690265.11470251.0990543麻保沙星Marbofloxacin4.60363.14631320.1041172.08078-44萘啶酸Nalidixicacid9.22233.09207205.06077187.05020-45诺氟沙星Norfloxacin4.70320.14050276.15067233.10847256.1444446氧氟沙星Ofloxacin4.80362.15106318.16123261.10338-47培氟沙星Pefloxacin4.80334.15615290.16632233.10847-48沙拉沙星Sarafloxacin6.20386.13107342.14030299.09810322.1333049Macrolide交沙霉素Josamycin8.92828.47400174.11247109.06479600.3378450(大环内酯类,6种)吉他霉素Kitasamycin8.60786.46343558.32727174.11247109.0647951替米考星Tilmicosin6.20869.57332174.1124788.07569126.1274052罗红霉素Roxithromycin9.10837.53185679.43755158.11756116.1069953泰妙菌素Tiamulin9.00494.32986192.10528119.01613-54泰乐菌素Tylosin7.50916.52643772.44778174.1124788.0756955Lincosamides林可霉素Lincomycin4.00407.22103126.12773359.21766-56(林可胺类,2种)克林霉素Clindamycin6.00425.18715126.12772377.18378-57Chloramphenicols氟苯尼考Florfenicol7.40355.99319335.98696185.02779119.0502458(氯霉素类,3种)甲砜霉素Thiamphenicol5.70353.99752290.02593185.02779119.0502459氯霉素Chloramphenicol7.60321.00505257.03346194.04588176.0353260β-Lactam阿莫西林Amoxicillin3.58366.11182208.04267134.06004114.0008161(β-内酰胺类,2种)苯唑西林Oxacillin9.76402.11182243.07642160.04268144.0443962Nitroimidazoles甲硝唑Metronidazole4.24172.07167128.0454582.02874-63(硝基咪唑类,2种)羟基甲硝唑Metronidazole-hydroxy3.70188.06658144.04037126.02980123.0552964Benzimidazoles阿苯达唑Albendazole7.90266.09577234.06956191.01478159.0427165(苯并咪唑类,7种)阿苯达唑亚砜Albendazolesulfoxide5.82282.09069240.04374208.01752191.0147866奥吩达唑Oxfendazole6.80316.07504284.04882223.05760191.0325467氟苯达唑Flubendazole8.70314.09355282.06733123.02470-682-氨基氟苯咪唑2-Amino-flubendazole6.60256.08807123.02407113.03972133.0634569甲苯达唑Mebendazole8.30296.10297264.07675105.0334995.0491470噻苯达唑Thiabendazole4.40202.04334175.03244131.06037-71Quinoxalines(喹啉类,4种)3-甲基喹啉-2-羟酸3-Methyl-quinoxaline-2-carboxylicacid6.63189.06585145.07602118.0651392.0494872乙酰甲喹Mequindox6.00219.07642143.06037185.07094160.0631173喹乙醇Olaquindox3.82264.09788246.08732202.06110177.0658574喹烯酮Quinocetone9.77307.10772103.05423131.04941143.06037

*no data

2.3 方法的线性关系

高分辨质谱可以提供待测组分可能的元素组成，仅需采用全扫描并提取精确质量数色谱图即可完成定性定量，利用自动触发的二级质谱采集完成准确定性[28]。因此，在检出限浓度下，只要保证多种药物能够全部检出并能准确定性即可，样品基质效应基本可以忽略。本实验采用溶剂标准曲线法或单点法进行定性定量。

将混合标准中间液用初始流动相稀释成质量浓度为2、5、10、20、50、100、500、1 000、2 000 ng/mL的标准曲线工作溶液，按照本方法进行检测，以待测物的分子离子峰面积对其质量浓度(ng/mL)进行线性回归，获得各目标化合物的标准曲线。结果表明,74种化合物在各自区间内线性良好,相关系数r2>0.99(见表2)。

表2 74种目标药物的相关系数、线性范围及在检出限加标浓度下的回收率与相对标准偏差(RSD)Table 2 Correlation coefficients,linear ranges,recoveries and relative standard deviations(RSD) at LOD spiked level of 74 targeted compounds

(续表2)

Compoundr2Linearrange(ng/mL)Recovery(%)RSD(%)Sarafloxacin0.99812～50066.68.0Sulfabenzamide0.99672～100084.96.9Sulfacetamide0.99682～50098.115Sulfachloropyridazine0.99922～100074.411Sulfadiazine0.99762～10001029.0Sulfadimethoxine0.99822～100099.65.1Sulfadoxine0.99942～100090.011Sulfaguanidine0.99902～50039.811Sulfalen0.99942～100086.020Sulfamerazine0.99872～10001459.4Sulfameter0.99652～100064.720Sulfamethazine0.99922～100011210Sulfamethizole0.99912～100065.812Sulfamethoxazole0.99932～100065.36.4Sulfamethoxypyridazine0.99532～100084.02.6Sulfamonomethoxine0.99902～10001157.9Sulfamoxol0.99752～10001193.7Sulfanitran0.99782～100076.15.9Sulfaphenazole0.99852～10001084.9Sulfapyridine0.99762～100095.84.4Sulfaquinoxaline0.99862～100087.84.9Sulfathiazole0.99602～10001234.9Sulfisomidine0.99512～2001205.0Sulfisoxazole0.99912～100075.45.4Tetracycline0.99142～5001068.3Thiabendazole0.99622～20075.29.2Thiamphenicol0.99052～5069.413Tiamulin0.99752～100071.19.2Tilmicosin0.99065～50066.021Trimethoprim0.99232～10063.79.4Tylosin0.99342～100091.59.0

2.4 假阴性率与检出限

根据FDA-SANTE/11813/2017,定性筛选法的检出限是在至少95%的样品中检测到分析物的最低含量水平[27]。基于检出限的筛查方法验证应分析至少20个检出限加标量的样品。经实验考察，在10 ng/mL加标量下，20个平行样品中74种药物均能检出，满足假阴性率<5%的要求，因此确定检出限为10 ng/mL。空白样品在检出限加标量下的回收率见表2，74种药物的回收率集中在55.8%～120%，相对标准偏差为1.3%～21%。由于本方法仅用于定性分析，因此对分析物的回收率无要求[27]。

2.5 实际样品的检测

图1 实际样品中检出药物的提取离子色谱图Fig.1 Extract ion chromatograms of the detected compounds in real samplesA:oxytetracycline,B:3-methyl-quinoxaline-2-carboxylic acid,C:olaquindox,D:chlortetracycline,E:amoxicillin,F:trimethoprim,G:albendazole sulfoxide

3 结 论

本文利用四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱可在单次分析中迅速筛选数百种不同化合物的高分辨率优势，建立了猪尿中10类74种抗生素及其他化合物的UPLC-Q-Exactive Orbitrap快速筛查和确证方法。该方法快速简便、准确度高，有效提高了检测效率，适用于猪尿中多种抗生素及其他化合物的快速定性确证，为养殖业药物使用情况的监管提供了有力的技术支持。