张瑜，张富赓，张少强，朱明丹，肖学凤，杜武勋#

（1.天津中医药大学研究生院，天津301617；2.天津市环湖医院药剂科，天津 300350；3.天津中医药大学第二附属医院心血管内科，天津 300150；4.天津中医药大学中药学院，天津 301617）

芪苈强心胶囊由《金匮要略》中的葶苈大枣泻肺汤加减而成[1]，由黄芪、附子、人参、丹参、葶苈子等11味饮片组成，用以治疗轻、中度充血性心力衰竭，具有益气温阳、活血通络、利水消肿的功效[2]。对于高血压、心肌病、冠心病、肺心病等合并慢性心力衰竭患者，在标准西医治疗基础上，加用芪苈强心胶囊能够进一步缓解临床症状，减轻药物副作用[3-5]。相关研究表明，芪苈强心胶囊不仅具有强心、利尿、扩血管作用，同时还能通过抑制心肌炎症反应与抗氧化应激，改善心肌细胞能量代谢，抑制心室重构[6-7]。芪苈强心胶囊中是哪些有效成分进入体内发挥药效作用暂不明确。中药药动学是目前阐明这些问题的根本途径[8-9]。因此，本课题组根据中药君臣佐使的配伍原则，以芪苈强心胶囊中臣药葶苈子为研究对象进行药动学研究，其中葶苈子的有效成分主要以芥子碱硫氰酸盐、槲皮素和山柰酚为主[10-13]。基于此，笔者建立高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）法，考察芪苈强心胶囊臣药葶苈子中芥子碱硫氰酸盐、槲皮素和山柰酚在大鼠体内的药动学，为进一步明确芪苈强心胶囊的药效物质基础提供依据。

1 材料

1.1 仪器

LC-20A色谱仪（日本岛津公司）；API 4000质谱仪（美国应用生物系统公司）；XS 205电子天平（瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司）；MIKRO 220R低温高速离心机（德国Hettich公司）；Sorvall RC-6Plus离心机（美国Thermo公司）；Targin VX-02多管蜗旋振荡器（北京踏锦科技有限公司）。

1.2 药品与试剂

芪苈强心胶囊（石家庄以岭药业股份有限公司，批号：140805，其中芥子碱硫氰酸盐1.167 mg/g、槲皮素0.019 mg/g、山柰酚0.030 mg/g）；芥子碱硫氰酸盐对照品（批号：111702-201504，纯度：99.5%）、槲皮素对照品（批号：100081-201509，纯度：98.6%）、山柰酚对照品（批号：110861-201509，纯度：99.0%）、氯霉素（内标）对照品（批号：130555-201203，纯度：99.8%）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯，水为超纯水。

1.3 动物

SD大鼠，♂，6只，体质量（220±20）g，SPF级，由解放军军事医学科学院实验动物中心提供，生产许可证号SCXK（军）-2014-0004，动物房温度（22±2）℃，湿度（50±10）%，适应性喂养1周后进行实验。本实验经过天津中医药大学伦理委员会批准。

2 方法与结果

2.1 色谱及质谱条件

2.1.1 色谱条件 色谱柱：Agilent ZOBRAX XDB-C18（50 mm×4.6 mm，3.5 μm）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-含0.1%甲酸的乙腈溶液（B）梯度洗脱（0.01～0.6 min，7%B；0.6～0.8 min，7% →15%B；0.8～7.8 min，15%→65%B；7.8～8.8 min，65%→100%B；8.8～9.8 min，100%B；9.8～9.81 min，100%→7%B；9.81～12 min，7%B）；流速：0.45 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：10µL。

2.1.2 质谱条件 离子源：电喷雾离子源（ESI）；检测模式：负离子模式；扫描方式：多反应监测（MRM）；喷雾电压：－4 200 V；脱溶液温度：600 ℃；气帘气：20 L/min；雾化气：65 L/min；加热辅助气：55 L/min。定量离子为芥子碱硫氰酸盐质荷比（m/z）310.2→251.2（解簇电压：－170 V，碰撞能量：－52 V，出口电压：－13 V），槲皮素m/z301.1→150.7（解簇电压：－70 V，碰撞能量：－26 V，出口电压：－5 V），山柰酚m/z286.2→242.0（解簇电压：－75 V，碰撞能量：－46 V，出口电压：－11 V），氯霉素m/z320.9→151.9（解簇电压：－50 V，碰撞能量：－20 V，出口电压：－15 V）。

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取芥子碱硫氰酸盐、槲皮素和山柰酚对照品适量，以二甲基亚砜（DMSO）溶解制成质量浓度为2 mg/mL的对照品贮备液。精密量取上述对照品贮备液适量，通过甲醇-水溶液（1∶1，V/V）稀释得到芥子碱硫氰酸盐质量浓度为0.5、1、2.5、10、25、100、250、1 000 ng/mL、槲皮素及山柰酚质量浓度均为1、2、5、20、50、200、500、2 000 ng/mL的混合对照品溶液。以上溶液均保存于4℃冰箱。

2.2.2 内标溶液的制备 精密称取氯霉素对照品适量，用甲醇-乙腈溶液（1∶1，V/V）溶解并制成质量浓度为20 ng/mL的内标溶液，置于4℃贮存备用。

2.3 血浆样品处理

取大鼠血浆样品50 μL，加入10 μL维生素C溶液（1.4 mg/mL，抗氧化剂）和150 μL 内标溶液，蜗旋30 s，离心10 min（4 ℃，15 000 r/min），取上清液，氮气吹干，测定前用100 μL 50%甲醇水复溶，取10µL进样分析。

2.4 方法学考察

2.4.1 专属性 取空白血浆、空白血浆+混合对照品溶液、灌胃给药20 min后大鼠血浆，按“2.3”项下方法处理血浆样品，再按“2.1”项下色谱及质谱条件进样分析，记录色谱图。结果，芥子碱硫氰酸盐、槲皮素、山柰酚和氯霉素互不干扰，峰形良好，且不会受到大鼠血浆样品中杂质及内源性物质的干扰，表明方法专属性良好。典型MRM色谱图见图1。

图1 典型MRM色谱图Fig 1 Representation MRM chromatograms

2.4.2 线性关系与定量下限 取空白血浆50 μL，分别加入不同质量浓度的芥子碱硫氰酸盐、槲皮素和山柰酚的混合对照品溶液，配制成芥子碱硫氰酸盐质量浓度为0.05、0.1、0.25、1、2.5、10、25、100 ng/mL，槲皮素和山柰酚质量浓度均为0.1、0.2、0.5、2、5、20、50、200 ng/mL的系列溶液。按“2.3”项下方法处理血浆样品，“2.1”项下色谱及质谱条件进样分析，以各成分对照品质量浓度为横坐标（x），对照品与内标峰面积比值为纵坐标（y）进行线性回归，得到芥子碱硫氰酸盐的回归方程为y＝2.91×10－2x+0.015（r＝0.999 4），线性范围为0.05～100 ng/mL，定量下限为0.05 ng/mL；槲皮素的回归方程为y＝4.5×10－3x+0.001 7（r＝0.999 7），线性范围为0.1～200 ng/mL，定量下限为0.1 ng/mL；山柰酚的回归方程为y＝8.0×10－4x+0.001 3（r＝0.999 9），线性范围为0.1～200 ng/mL，定量下限为0.1 ng/mL。

2.4.3 精密度与准确度 取空白血浆，分别加入适量混合对照品溶液，得到芥子碱硫氰酸盐（0.1、1、80 ng/mL）、槲皮素（0.2、2、160 ng/mL）、山柰酚（0.2、2、160 ng/mL）低、中、高3个质量浓度的血浆质控样品（QC），按“2.3”项下方法处理血浆样品，按“2.1”项下色谱及质谱条件进样分析，记录峰面积。于同日内连续进样6次，计算日内精密度及准确度；连续测定3 d，计算日间精密度及准确度。结果，血浆中芥子碱硫氰酸盐、槲皮素、山柰酚日内精密度的RSD均≤9.63%（n＝6），准确度在94.67%～101.21%、98.11%～102.00%、100.17%～102.71%之间；日间精密度的RSD均≤11.55%（n＝6），且准确度分别在98.43%～99.20%、98.97%～102.88%、99.54%～102.85%之间，满足生物样品测定的要求。

2.4.4 基质效应 取空白血浆50 μL，加入芥子碱硫氰酸盐、槲皮素及山柰酚低、中、高3个质量浓度的QC样品，每个质量浓度平行制备6份，按“2.3”项下方法处理血浆样品，再按“2.1”项下色谱及质谱条件进样分析，记录各成分峰面积（A）；另取甲醇水溶液代替空白血浆，测得成分峰面积（B），基质效应计算公式为A/B×100%。结果，芥子碱硫氰酸盐、槲皮素、山柰酚血浆样品低、中、高3个质量浓度的基质效应分别为101.61%～86.70%（RSD≤7.63%，n＝6）、101.41%～80.94%（RSD≤9.61%，n＝6）、79.92%～103.24%（RSD≤6.03%，n＝6）。基质效应结果见表1。

表1 基质效应结果Tab 1 Results of matrix effect

2.4.5 稳定性试验 取空白血浆50 μL，加入芥子碱硫氰酸盐、槲皮素及山柰酚低、中、高3个质量浓度的QC样品，按“2.3”项下方法处理血浆样品后，分别在室温放置24 h、自动进样器中放置24 h、－20℃条件下反复冻融3次、－80℃条件下放置30 d考察样品稳定性。结果，芥子碱硫氰酸盐、槲皮素、山柰酚样品在上述条件下稳定，各成分测得浓度均值与标示浓度的RE≤14.69%。

2.5 药动学研究

取大鼠6只，给药前禁食12 h，自由饮水。灌胃给予1.3 g/kg芪苈强心胶囊混悬液[根据临床用量换算而得，人与大鼠的换算系数Rab为6.17[14]]，于给药后0.083、0.167、0.333、0.667、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h经目内眦静脉丛取血约0.5 mL，置于肝素化抗凝管中，离心10 min（4 ℃，12 000 r/min），取上层血浆，按“2.3”项下方法处理血浆样品，并按“2.1”项下色谱及质谱条件进样分析，采用DAS 3.0软件非房室模型计算药动学参数。结果，大鼠灌胃芪苈强心胶囊后血浆中芥子碱硫氰酸盐、槲皮素和山柰酚的药-时曲线见图2，主要药动学参数见表2。

图2 大鼠体内芥子碱硫氰酸盐、槲皮素和山柰酚的药-时曲线Fig 2 Plasma concentration-time curves for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats

表2 大鼠灌胃芪苈强心胶囊后芥子碱硫氰酸盐、槲皮素和山柰酚的药动学参数（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats after intragastric administration of Qili qiangxin capsule（±s，n＝6）

表2 大鼠灌胃芪苈强心胶囊后芥子碱硫氰酸盐、槲皮素和山柰酚的药动学参数（±s，n＝6）Tab 2 Pharmacokinetic parameters for sinapine thiocyanate，quercetin and kaempferol in rats after intragastric administration of Qili qiangxin capsule（±s，n＝6）

药动学参数cmax，ng/mL tmax，h t1/2，h CL，mL/（h·kg）Vd，mL·h/kg AUC0-24 h，h·ng/mL AUC0-∞，h·ng/mL芥子碱硫氰酸盐1．35±0．62 1．5±0．00 3．98±0．99 3 683．82±987．96 28 715．50±7 659．82 3．98±1．21 8．76±2．85槲皮素3．23±1．26 0．67±0．00 3．33±0．41 2 852．33±695．88 13 998．15±4 878．43 10．96±3．42 15．03±5．28山柰酚5．26±1．66 0．67±0．00 4．54±0．85 1 611．85±129．59 10 356．47±1 402．80 13．59±5．35 18．91±1．54

3 讨论

芪苈强心胶囊长期应用于临床，可显著降低慢性心力衰竭患者明尼苏达生活质量评分、减少复合终点事件发生率[15-16]。其相关的药理作用报道较多，但芪苈强心胶囊方中潜在效应成分的药动学特征研究较少，而复方药动学研究对于揭示中药作用的物质基础及作用机制，促进中医药的现代化具有重要的意义[17-19]。因此，本课题组以臣药葶苈子为例，分别选择质量控制成分芥子碱硫氰酸盐和药物效应成分槲皮素、山柰酚对芪苈强心胶囊在大鼠体内的药动学特征进行考察。

药动学结果显示，大鼠灌胃芪苈强心胶囊后槲皮素、山柰酚可被快速吸收入血，0.67 h即达到峰浓度（cmax），cmax分别为（3.23±1.26）、（5.26±1.66）ng/mL，芥子碱硫氰酸盐达峰时间在1.5 h左右，cmax为（1.35±0.62）ng/mL；3种成分在生物体内清除较快，半衰期（t1/2）相接近，在3.33～4.54 h之间，且芥子碱硫氰酸盐的血浆清除率[CL＝3 683.82 mL/（h·kg）]高于槲皮素[CL＝2 682.33 mL/（h·kg）]及山柰酚[CL＝1 611.85 mL/（h·kg）]，说明前者被代谢的速度最快，在体内停留的时间最短；表观分布容积（Vd）通常与血药浓度成反比，代表药物的组织摄取程度[20]，本实验中Vd从大到小排序依次为芥子碱硫氰酸盐＞槲皮素＞山柰酚，说明芥子碱硫氰酸盐的组织摄取度多，体内分布广泛；AUC反映药物进入人体循环的相对量，是衡量药物利用程度的重要参数[21]，本实验中芥子碱硫氰酸盐的AUC明显低于槲皮素、山柰酚，这可能与芥子碱硫氰酸盐在体内清除率高、分布容积大而降低了体内的暴露量有关。

本研究建立了HPLC-MS/MS法测定芪苈强心胶囊臣药葶苈子中主要成分芥子碱硫氰酸盐、槲皮素、山柰酚在大鼠体内的血药浓度，并阐释各效应成分的体内过程，可为进一步确定芪苈强心胶囊的药效物质基础提供依据。