秦 凤 张惠莉

(青海大学附属医院内分泌科，西宁810001)

糖尿病肾病(Diabetic nephropathy，DN)是糖尿病最常见的微血管并发症之一，也是临床导致终末期肾脏疾病的首要原因[1]。并发症早期防治一直是糖尿病临床管理的重中之重，越来越多的证据表明[2，3]，从细胞、分子和基因水平上寻找敏感标志物对糖尿病微血管病变的早期预测具有积极意义。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性的非编码小分子RNA，广泛参与了生物体生长发育、生理功能和病理机制的调控。其中miR-21主要参与纤维化损伤，纤维化损伤是在各种急慢性刺激的诱导下而发生的细胞坏死、细胞外基质(Extracellular matrix，ECM)增多和纤维结缔组织沉积的病理过程，持续发展可导致器官衰竭[4]。研究已证实在肾细胞癌中，转化生长因子TGF-β诱导的纤维化损伤与miR-21之间存在相互调节的负反馈机制，在糖尿病肾病大鼠模型中也发现了类似现象，miR-21高表达可诱导肾小球硬化和肾间质纤维化损伤，这一功能依赖于与TGF-β/smad3通路的协同作用[5]。但目前多数研究集中于动物或细胞实验，对临床患者的研究尚不多见，本研究重点考察糖尿病肾病患者外周血miR-21表达水平与肾间质损伤之间是否存在相关性。

1 资料与方法

1.1资料

1.1.1一般资料 本研究经本院伦理委员会批准，所有受试者均自愿签署知情同意书。病理对象为本院2016年1月～2018年1月收治的145例糖尿病及DN患者；其中男77例，女68例；年龄33～75岁，平均(45.5±10.5)岁。诊断标准:①2型糖尿病诊断参照WHO 1999年制定的糖尿病诊断标准；②糖尿病肾病参照糖尿病肾病防治专家共识(2014年版)[6]。纳入标准:①糖尿病为2型糖尿病；②糖尿病肾病Mogensen分期Ⅱ～Ⅳ期；③身体质量指数18.5～27 kg/m2。排除标准:①泌尿系统结石、囊肿或其他占位性病变；②脑梗死；③免疫系统缺陷；④近6个月有激素类药物或免疫调节剂应用史；⑤过敏体质或存在过敏史。根据疾病严重程度分为三组:中重度DN 41例，为Mogensen分期Ⅲ～Ⅳ期病例；轻度DN 44例，为Mogensen分期Ⅱ期病例；单纯糖尿病60例，指尚无糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变等糖尿病微血管并发症的糖尿病患者；另以60例同期入院体检的健康志愿者为对照组；各组患者基础资料如表1所示，在年龄、性别、体质量指数、基础合并症方面，差异无统计学意义(P>0.05)；糖尿病病程、空腹血糖值(Blood sugar，BS)和糖化血红蛋白A1c(Glycated hemoglobin A1c,HBA1c)的差异有统计学意义(P<0.05)。

1.1.2主要仪器和试剂 荧光定量PCR仪(LightCycler480，上海罗氏)；全自动酶联免疫分析仪(BIOBASE2000，山东博科)；全自动化学发光免疫分析仪(UniCel Dxl 800，德国贝克曼库尔特)；水平电泳仪(DYCZ-24K，北京六一仪器厂)；紫外-可见光分光分析系统(Thermo E 300，北京百道亨仪器设备有限公司)；全血microRNA快速提取试剂盒(D1803，新海基因检测有限公司)；microRNA反转录试剂盒(D1801，新海基因检测有限公司)；荧光定量PCR Mix(A2201，新海基因检测有限公司)；引物由新海基因检测有限公司设计合成；肾功能检测试剂购自透景生命科技股份有限公司；纤维化标志物检测试剂购自杭州泰格医药科技有限公司。

1.2方法

1.2.1miR-21表达测定方法 所有受试者，均取晨空腹肘静脉血，分为两管，一管采用荧光定量PCR实验测定miR-21表达，另一管分离血清测定肾功能标志物和纤维化损伤标志物。荧光定量PCR实验步骤:①采用血液microRNA快速提取试剂盒提取外周血中的microRNA，操作步骤严格参照说明书，最终经吸附柱RA洗脱后，收集到浓度较高、质量较稳定的microRNA。琼脂糖凝胶电泳，紫外吸收测定法鉴定完整性和纯度，完整性合格标准:28 s 和18 s条带清晰，28 s亮度约为18 s的1.5～2.0倍；纯度合格标准:OD260/OD280=1.8～2.1。②反转录(RT)实验生成cDNA，按照microRNA反转录试剂盒配置体系，置于荧光定量PCR仪反应，反应条件:16℃×30 min→42℃×40 min→85℃×5 min。③所得RT产物自动进行实时定量荧光PCR反应，以U6为内参，miR-21和U6分开测定，加入miR-21或U6上下游引物和荧光定量PCR Mix配置体系，PCR产物的溶解曲线观察扩增产物的特异性，根据扩增曲线自动计算表达量。

表1 各组患者基础资料比较

Tab.1 Basic data compare between groups

GroupsnAge(yr)Gender(M/F)Body massindex(kg/m2)Basal complications[n(%)]Coronary heart diseaseHypertensionHyperlipaemiaDuration ofdiabetes (yr)BS(mmol/L)HBA1c(%)Controls6045.8±10.435/2523.5±2.3746--5.24±0.745.85±0.74Diabetes6046.1±12.230/3024.1±2.45694.58±0.657.84±0.886.85±0.93Mild DN4445.2±13.125/1923.8±2.15256.33±0.848.05±0.757.31±0.86 Severe DN4145.4±11.522/1923.6±2.24647.52±1.028.08±1.127.85±0.93F/χ2-0.9520.9520.0680.4013.1850.95524.18816.52627.632P-0.4170.8130.9760.9400.3640.812<0.001<0.001<0.001

1.2.2血清学标志物测定方法 所得血液样品，室温静置1 h，4 000 r/min离心15 min分离血清，离心半径8 cm。采用全自动酶联免疫分析仪和肾功能检测试剂测定血清肾功能标志物血肌酐、尿氮素、尿酸及胱抑素C(胱抑素)水平，检测原理依次为肌氨酸氧化酶法、免疫比浊法、尿酸酶法和免疫比浊法；采用化学发光免疫分析仪和纤维化标志物测定试剂测定纤维化损伤标志物转化生长因子(TGF-β)、透明质酸(HA)、Ⅳ型胶原(CⅣ)、Ⅲ型前胶原(PCⅢ)。

2 结果

2.1各组受试者外周血miR-21表达结果 如图1所示，miR-21和内参U6荧光定量PCR实验的溶解曲线显示出良好的单峰，证明所得产物特异性良好，最终结果显示轻度DN和中重度DN的miR-21 mRNA表达水平高于对照组和单纯糖尿病，中重度DN组的miR-21 mRNA表达水平高于轻度DN，差异有统计学意义(P<0.05)；见表2。

2.2各组受试者肾功能测定结果 单纯糖尿病、轻度DN和中重度DN的血肌酐、尿氮素、尿酸及胱抑素水平高于对照组，轻度DN和中重度DN高于单纯糖尿病，中重度DN高于轻度DN，差异有统计学意义(P<0.05)；见表3。

图1 miR-21和U6 荧光定量PCR的溶解曲线Fig.1 High resolution melting curve of fluorogenic quantitative PCR assay for miR-21 and U6Note: The dissolution curves of both miR-21 and U6 were single peaks,indicating good specificity of samples and high purity.The peak temperature of miR-21 was 73.5℃,U6 was 75℃.

GroupsnPeripheral miR-21 expressionControls600.852±0.203Diabetes600.905±0.337Mild DN441.005±0.3951)2)Moderate-severe DN411.435±0.5021)2)3)F-3.224P-0.025

Note：Compared to controls,1)P<0.05;compared to diabetes,2)P<0.05;compared to mild DN,3)P<0.05.

GroupsnSerum creatinine(μmol/L)Urinary nitrogen(mmol/L)Uric acid(μmol/L)Cystatin(mg/L)Controls6063.5±11.44.8±0.6203.5±32.50.75±0.11Diabetes6077.6±13.51)7.2±1.21)275.4±44.61)1.03±0.261)Mild DN44102.3±16.51)2)11.4±1.91)2)372.5±53.21)2)1.42±0.331)2) Moderate-severe DN41146.8±17.21)2)3)14.8±1.71)2)3)543.5±56.81)2)3)1.77±0.431)2)3)F117.25088.245102.22433.441P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared to controls,1)P<0.05;compared to diabetes,2)P<0.05;compared to mild DN,3)P<0.05.

GroupsnTGF-β(μg/L)HA(μg/L)CⅣ(μg/L)PCⅢ(μg/L)Controls606.85±0.8531.5±4.4844.2±5.5223.5±3.26Diabetes608.33±0.961)42.5±4.521)55.6±6.851)32.7±4.221)Mild DN4411.24±1.151)2)56.5±5.691)2)63.5±6.681)2)48.6±5.211)2) Moderate-severe DN4113.74±1.091)2)3)77.6±6.331)2)3)88.4±7.581)2)3)52.3±6.351)2)3)F88.526185.24176.25166.335P0.0000.0000.0000.000

Note：Compared to controls,1)P<0.05;compared to diabetes,2)P<0.05;compared to mild DN,3)P<0.05.

表5 各类受试者miR-21 mRNA表达水平与血清学标志物Pearson检验结果

Tab.5 Pearson test results of relationship between miR-21 mRNA expression and serologic markers

2.3各组受试者纤维化标志物测定结果 单纯糖尿病、轻度DN和中重度DN的TGF-β、HA、CⅣ及PCⅢ水平高于对照组，轻度DN和中重度DN高于单纯糖尿病，中重度DN高于轻度DN，差异有统计学意义(P<0.05)；见表4。

2.4相关性考察 Pearson检验结果显示，糖尿病肾病患者外周血miR-21 mRNA表达水平与血肌酐、尿氮素、胱抑素、TGF-β、CⅣ、PCⅢ均呈直线正相关性(r依次=0.625、0.584、0.617、0.714、0.557、0.735，P<0.05)，单纯糖尿病患者和对照组miR-21 mRNA表达与血清学标志物之间无明显相关性(P>0.05)，见表5。进一步采用ROC曲线分析miR-21 mRNA表达水平对DN和中重度DN的预测价值，结果显示miR-21 mRNA表达对DN和中重度DN均有预测价值(P<0.05)，详见图2。

图2 外周血miR-21 mRNA表达水平预测DN和中重度DN的ROC曲线Fig.2 ROC Curve of peripheral miR-21 mRNA express-ion to predict DN and severe DNNote: A.Mainly results for DN,AUC=0.669,P=0.015,best operating point=1.045,sensitivity=0.750,specificity=0.553;B.Mainly results for severe DN,AUC=0.846,P=0.000,best operating point=1.255,sensitivity=0.889,specificity=0.750.

3 讨论

作为标志物进行疾病诊断与病情评估，miRNA有三方面的优势，一是miRNA在人体内分布广泛，不仅存在于器官、骨骼和肌肉，在外周血、尿液和组织液也普遍存在，能够实现无创取样，取样便捷；二是miRNA稳定性高，相较于其他容易被机体代谢的物质，不容易受到检测时间的影响；三是荧光定量PCR的敏感度极高，能够实现对痕量物质的高精度定量，即使是miRNA含量极微的血清样本，也能实现miRNA定量。miR-21是miRNA家族的重要成员之一，人miR-21基因定位于17q23.2，最初被认为是一种癌基因，在卵巢癌、结直肠癌、胃癌等多种癌症中均呈高表达，能够通过多种途径提高肿瘤的侵袭性[7-9]。在肾细胞癌中，目前的多数研究结论支持miR-21高表达可促进肾细胞癌的发生与发展[10]，是临床预后不良的独立危险因素[11]。但在糖尿病肾病中，miR-21具体发挥何种作用还存在较大程度的争议。

部分学者认为[12,13]，miR-21高表达是一种代偿性反馈机制，可以拮抗TGF-β/smad信号通路引起的纤维化损伤及高糖引起的肾小球损伤，因此合理上调miR-21对糖尿病肾病起治疗作用。也有学者指出[14，15]，miR-21参与了肾间质纤维化损伤的病理进程，且其促纤维化作用受到TGF-β的诱导，依赖于smad3，miR-21的高表达可降低靶基因人类第十号染色体缺失与磷酸酶和张力蛋白同源基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromsome ten，PTEN)的翻译，从而激活下游蛋白激酶B(protein kinase B，AKT)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体(mammalian rapamycin target protein complex，mTORC1)相关通路的表达，促进ECM形成和纤维结缔组织增生。Wu等[16]也发现姜黄素衍生物C66即可通过抑制miR-21表达而缓解糖尿病肾病的肾间质损伤。本研究分析健康人群、单纯糖尿病患者及不同发病程度的DN患者外周血miR-21变化趋势，发现轻度DN和中重度DN的miR-21 mRNA表达水平高于对照组和单纯糖尿病，中重度DN组的miR-21 mRNA表达水平高于轻度DN。该结果与台湾学者Chien等[17]对50例糖尿病肾病临床患者的调查结果基本一致，均支持第二种观点。

DN的早期病理变化为肾小球和肾小管基底膜增厚和ECM逐渐堆积，在这个过程中，肾间质纤维化损伤已经开始；发展至DN晚期，纤维化损伤累及肾小管，肾单位受到严重破坏而出现大量蛋白尿、肾功能不全甚至肾衰竭[18]。为考察miR-21与肾间质损伤的关系，本研究进一步分析了miR-21 mRNA表达水平与患者肾功能和纤维化损伤标志物的相关性。在纤维化指标方面，研究选取了TGF-β、HA、CⅣ、PCⅢ 四项，其中TGF-β是miR-21介导纤维化损伤的重要协同因子，HA、CⅣ和PCⅢ是ECM的重要组成成分。结果证实糖尿病肾病患者外周血miR-21 mRNA表达水平与血肌酐、尿氮素、胱抑素、TGF-β、CⅣ、PCⅢ均呈直线正相关性，单纯糖尿病患者和对照组miR-21 mRNA表达与肾功能损伤和肾间质纤维化的血清学标志物之间无明显相关性，可能是由于单纯糖尿病患者和对照组患者肾脏均无明显损伤，这一结果进一步证实了miR-21在DN病理机制中介导了不可忽视的作用。另外，本研究还发现，在DN患者和单纯性糖尿病患者中，miR-21还与糖尿病病程及HBA1c有关，与BS值无明显相关性，这主要是因为糖尿病患者常年应用血糖控制药物，入院时BS值较大程度上受到了药物干预的影响，与DN疾病严重程度并不直接相关。而糖尿病肾病的肾损伤程度与糖尿病病程和HBA1c均呈正相关性，这一点已得到较多学者的证实[19,20]，两者与miR-21均与肾损伤程度紧密关联，故而也存在一定的相关性。进一步的数据分析结果显示，miR-21 mRNA表达对DN和中重度DN均有预测价值，该结果证实外周血miR-21表达水平与肾间质损伤程度密切相关，能够从一定程度上预测DN的发生与发展。

本研究尚有两点不足之处，一是肾间质纤维化损伤的评估指标缺乏器官特异性，目前临床上尚没有针对肾纤维化损伤的专用指标，本研究所用的TGF-β、HA、CⅣ、PCⅢ为器官纤维化损伤的通用指标；二是miR-21在糖尿病肾病中的作用可能是一把双刃剑，在不同的病理阶段介导不同的作用，具有不同的变化趋势，本研究未从各个病理阶段进行平行考察，结果和结论可能存在一定的局限性。